血管内皮细胞糖萼在大鼠急性肺损伤中的作用

唐丽　夏瑞　李弦

【摘要】 目的：探索肺血管内皮细胞糖萼在肺损伤中的作用。方法：采用盲肠结扎穿孔法构建大鼠脓毒症急性肺损伤模型。将30只大鼠随机分为3组，A组为空白对照组，B组为脓毒症组，C组为肝素钠预处理脓毒症组。24 h后观察大鼠肺组织病理切片、动脉血氧分压和细胞凋亡指数，ELISA法检测血清中硫酸乙酰肝素酶（HPA）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、硫酸乙酰肝素（HS）和多配体聚糖（Syndecan-1）的含量。结果：与A组比较，B组和C组病理切片均有明显肺损伤表现，动脉血氧分压中氧分压降低，二氧化碳分压升高，细胞凋亡指数较高；与B组比较，C组动脉血氧分压中氧气分压增高，二氧化碳分压降低，细胞凋亡指数较低；ELISA法结果表明，与A组比较，B组和C组HPA、MMP-9含量较少，HS和Syndecan-1含量显著较高；与B组比较，C组HPA、MMP-9较高，HS和Syndecan-1较低，差异均有统计学意义。结论：肺血管内皮细胞糖萼在急性肺损伤进程中起到保护作用。

【关键词】 肺血管内皮细胞糖萼； 急性肺损伤； 保护作用

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.3.087 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）03-0162-02

急性肺损伤（acute lung injure，ALI）是临床上常见的肺部损伤，是呼吸系统最严重的疾病之一，严重时可以导致患者死亡。血管内皮細胞糖萼（endothelial glycocalyx layer，EGL）是一种网状的绒毛结构，覆盖在血管内皮的腔面，主要由氨基葡聚糖（glycosaminoglycan，GAG），蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）和膜糖蛋白（glycoproteins）组成。正硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）是内皮细胞糖萼分布最多的糖胺聚糖。脱氧胆酸钠（SDC）是PGs的核心蛋白之一。血管内皮细胞糖萼是血管屏障的重要组成部分，通过改变血管内皮细胞通透性，阻隔中性粒细胞外渗和黏附，提供对血管的保护作用。HPA和MMP-9是糖萼的破坏因素，而硫酸乙酰肝素（HS）和多配体聚糖（Syndecan-1）是糖萼脱落的标志物。HPA是分解HS的酶，MMP-9可以降解Syndecan-1蛋白[1-2]。本研究建立大鼠肺损伤模型，利用肝素钠作为肺内皮细胞糖萼的保护性因素，通过检测肺组织内细胞凋亡数、肺血氧分压状况、血清HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1含量及观察镜下肺组织的病理改变情况，对EGL在急性肺损伤中的作用进行探索性的研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

30只雄性健康SD大鼠（湖北省疾病控制中心提供），体重210～260 g，将大鼠随机分为3组：常规对照组（A组，10只）、常规肺损伤建模组（B组，10只）、肝素预处理肺损伤建模组（C组，10只）。

1.2 方法

1.2.1 试剂与药品 血气分析仪（ABBOTT i-STAT），实验中所用试剂购自武汉谷歌生物科技有限公司，细胞凋亡测试盒购自武汉博士德生物工程有限公司，ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2.2 急性肺损伤大鼠模型 大鼠麻醉用药为3%戊巴比妥钠（40 mg/kg），将所有大鼠注射麻醉后，对C组大鼠经尾静脉注射肝素（2 mg/ml）3 ml/kg进行预处理，对照组注入等量生理盐水，而后按照文献[3]介绍的盲肠结扎穿孔法建造脓毒症肺损伤模型。常规消毒铺巾，沿腹正中切口切开，切口长2～3 cm，打开腹腔，游离肠系膜和盲肠，环形结扎盲肠1/2处，用50 ml注射器9号针头穿孔于盲肠和尾端中点，挤出少许内容物，还纳肠管，保证肠道通畅，对伤口进行逐层缝合。伤口消毒后以5 ml/100 mg生理盐水腹腔注射补液。

1.3 观察指标

（1）24 h后取大鼠股动脉血0.5 ml血气分析，而后处死大鼠，取右肺上叶1 cm3，4%多聚甲醛溶液固定、脱水、包埋、HE染色，在显微镜下对肺组织进行观察。记录视野内肺内皮、肺上皮阳性染色细胞数和细胞总数，计算凋亡指数（AI）=阳性细胞数/总细胞数×100%。（2）血清HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1含量检测。处死大鼠前，取大鼠血1 ml，4000 r/min离心15 min，取血清置于-80 ℃冰箱备用。HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1检测方法参照大鼠HPA、MMP-9、HS、Syndecan-l（sCD138） ELISA试剂盒说明书。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理改变

A组为空白对照组，大鼠肺泡组织、肺间质均较完整，无病理改变；B组肺泡及肺间质可见炎性细胞浸润及出血，结构发生严重破坏，肺毛细血管扩张，肺泡壁明显增厚。C组病理情况总体处于A组与C组之间，肺泡和肺间质有病理改变，但相较于B组程度较轻。

2.2 细胞凋亡情况

A组AI值最低，分布较分散，着色最浅。B组AI值最高，与A组比较，差异有统计学意义（P<0.05），C组AI值低于B组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 动脉血气分析

动脉血气分析结果表明，A组PaO2和PaCO2基本处于正常值，B组PaO2降低，PaCO2升高，C组相比于A组PaO2降低和PaCO2升高，但降低值和增高值不及B组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 血清HPA、MMP-9、HS和Syndecan-1含量

ELISA法结果表明，与A组相比，B组和C组HPA、MMP-9含量较低，HS和Syndecan-1含量显著较高；但C组HPA、MMP-9减少量、HS和Syndecan-1增高量不及B组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

盲肠结扎穿孔是多种病原微生物感染引发的脓毒症模型，能够很好地模拟临床上人类脓毒症的急性肺损伤[3-4]。本研究中，造模后大鼠出现发热，呼吸频率加快，心率加快、口鼻腔分泌物增多、腹泻、精神萎靡、竖毛、少动、血气分析显示模型组大鼠PaO2下降和PaCO2升高，都证明急性肺损伤模型构建成功。

急性肺损伤的主要病理变化为炎性因子刺激导致的细胞通透性增加，EGL的主要生理作用是在血管内皮形成分子层，能够具有炎性屏障和机械传导的功能，因此EGL对于减缓炎性损伤进程有重要作用[5-6]。肝素对EGL有保护功能，文献[7-8]研究表明，在大鼠脓毒症急性肾损伤模型中，给予静脉注射肝素，肾间质微血管内皮细胞和肾小球内皮细胞的乙酰肝素酶活化减少，內皮细胞糖萼破坏减少，从而分别导致肾间质白细胞浸润和肾小球滤过屏障破坏，引发炎症和蛋白尿情况明显降低。这证实了EGL在急性肺损伤中对肺组织的保护作用[9-10]。

本研究结果中，与A组相比，B组和C组HPA、MMP-9含量较少，HS和Syndecan-1含量显著较高；但与B组比较，C组HPA、MMP-9较高，HS和Syndecan-1较少，这表明在急性肺损伤的发生过程中，糖萼确实发生结构的破坏。而C组大鼠的急性肺损伤程度明显较低，说明血管内皮细胞糖萼的损伤情况与肺损伤程度呈相关性，糖萼破坏程度越高，肺损伤的程度越重。脓毒症时，损伤肺组织内大量细胞发生凋亡，调控细胞凋亡可能保护肺组织，但EGL破坏是否与细胞凋亡有关尚需研究证实[11-12]。

本研究初步证实了EGL在肺损伤发生时对血管内皮的保护作用，但预处理是在肺损伤发生前进行，而肺损伤是急进过程，相关物质是否能及时起效及起效时间尚未可知，需要进一步的研究后逐步在临床实施。

参考文献

[1]康红艳，刘佳佳，喻淼淼，等.血管内皮细胞糖萼的观测技术研究进展[J].生命科学，2016，29（9）：1089-1099.

[2]蒋婷婷.肝素对脓毒症大鼠肺血管内皮糖萼的保护作用[D].南京：东南大学，2014.

[3]董芳，徐亮，王华兵，等.复方高渗盐溶液对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响[J].华中科技大学学报医学版，2015，44（4）：440-444.

[4]卢骁，赵良，任黎勃.低分子肝素对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用[J].中国急救医学，2010，30（8）：720-724.

[5]方辰，张剑锋.肺内皮多糖包被与急性肺损伤的研究进展[J].中华灾害救援医学，2016，4（1）：42-45.

[6]胡淑玲，杨毅，邱海波.多糖包被在ARDS中的作用[J].中华医学杂志，2014，100（23）：1832-1834.

[7]赵晓禹.糖胺聚糖在脓毒症中内皮糖萼保护作用的研究[D].济南：山东大学，2016.

[8]蒋婷婷，孙佳凤，夏江燕，等.肝素酶在内毒素血症致大鼠血管内皮糖萼破坏中的作用[J].中华麻醉学杂志，2015，35（9）：1131-1133.

[9]叶梓，王世杰，李辉，等.血管内皮细胞中的凝血物质：理论研究新进展[J].中国组织工程研究，2017，21（4）：627-632.

[10]吴双，张涛，冯波，等.小鼠空肠黏膜微血管内皮细胞糖萼的透射电镜观察[J].解剖学报，2013，44（1）：111-113.

[11]陈娇，钱晓明，任艺，等.p38MAPK在百草枯中毒致大鼠急性肺损伤中的作用研究[J].中国急救医学，2014，34（2）：183-186.

[12]穆恩，丁仁彧，安欣，等.肝素通过抑制一氧化氮合酶和转化生长因子-β/Smad信号转导途径减轻脂多糖致大鼠急性肺损伤[J].中华危重病急救医学，2014，26（11）：810-814.

（收稿日期：2017-06-12）