5406放线菌培养条件的优化试验

李 丽 杨 倩 邢 力 秦秀丽

（吉林农业科技学院 吉林市 132101）

5406放线菌又称细黄放线菌（Actinomyces microflavus），在代谢过程中能够产生次级代谢抗菌素、生长素以及细胞分裂素等生物活性物质，能够刺激种子生根、发芽，对土著性病原菌具有较好的抑菌作用，减少种子受病害侵害，使土壤中无效磷、钾得到转化[1-2]。因此能促进作物生长，防止作物及果蔬枯萎病、白粉病等多种病害的发生，提高作物及果蔬的品质及产量[3-4]，是具有解钾、解磷、抗病、促生、保苗等多功能的抗生菌肥[5-6]，在绿色农业生产中具有较好的应用前景。目前培养5406放线菌试管菌种常用高氏1号培养基，由于长期使用该培养基以及对其生长的环境条件不甚了解，在5406放线菌培养过程中常发生菌丝生长慢、甚至停止生长，杂菌污染严重问题等，针对这些问题本试验对培养5406放线菌常用的高氏1号加富培养基以及生长的环境条件进行研究，对高氏1号加富培养基配方及生长的环境条件进行了优化，为5406放线菌菌种培养及菌肥的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：5406放线菌试管菌种由吉林农业科技学院生物工程学院微生物实验室提供。

1.1.2 供试药剂：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2S04、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、NaCL、琼脂、NaOH、维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素B12均为分析纯。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 菌种活化培养基：以高氏1号培养基为基础培养基及菌种活化培养基。其配方为可溶性淀粉20g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCl 0.5g、琼脂 18g、H2O 1000mL、pH为7.2。

1.1.3.2 供试培养基：以高氏1号培养基为基础培养基，分别添加10g葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等供试碳源至，配制供试高氏1号碳源加富培养基。

以高氏1号培养基为基础培养基，分别添加10g酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4等供试氮源，配制供试高氏1号氮源加富培养基。

维生素供试培养基：以高氏1号培养基为基础培养基，分别添加0.2g维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12等供试维生素，配制供试高氏1号维生素加富培养基。

1.1.4 主要设备及用具

超净工作台（SW-CJ-2FD型，上海新苗医疗器械）；高压蒸汽锅（MLS-3781L-CP型，松下医疗器械）；生化培养箱（HPS-280型，哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；智能培养箱（PGX-350A型）；电子天平（BSA224S-CW型，赛多利斯科学仪器）；游标卡尺；分析天平；移液枪等。

1.2 方法

1.2.1 供试菌种的活化

配制高氏1号基础试管培养基，在无菌条件下，用接种环从5406放线菌母种中挑取少许菌丝及孢子，试管培养基上划线接种，27℃恒温培养7天，选取菌落表面干燥、坚实多皱、菌丝洁白、致密的试管作为供试菌种，制备成104/mL孢子悬浮液。

1.2.2 高氏1号加富培养基（碳源、氮源、维生素）单因素试验

在高氏1号基础培养基按1.1.3.2分别加入供试碳源、氮源、维生素制备平板培养基，每个平板中接104/mL孢子悬浮液0.1mL，每个因素接20个平板，在27℃恒温培养7天，观测菌丝的长势以菌落直径[7]，确定高氏1号加富培养基中适宜的碳源、氮源、维生素。

1.2.3 高氏1号加富培养基最适配方的确定

根据1.2.2单因素试验结果，以筛选出的适宜碳源、氮源、维生素、pH为试验因素，设计L9（34）正交试验[8]（设计见表1），配制9种高氏1号加富培养基，每个试验组接20个平板。在27℃恒温培养7天，观测菌丝的长势以菌落直径，确定高氏1号加富培养基最佳组合。

表1 L9(34)营养液正交试验因素及水平

1.2.4 5406放线菌生长环境条件的单因素试验

1.2.4.1 5406放线菌生长适宜温度的确定：按照优化出的高氏1号加富培养基最适配方制作平板培养基，每个平板中接104/mL孢子悬浮液 0.1mL，分别放置于 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃生化培养箱中在无光条件下培养7天，每个水平接20个平板，观测菌丝的长势以菌落直径，确定5406放线菌生长的适宜的温度条件。

1.2.4.2 5406放线菌生长适宜光照条件的确定：按照优化出的高氏1号加富培养基最适配方制作平板培养基，每个平板中接104/mL 孢子悬浮液 0.1mL，分别放置于无光、100Lx、200Lx、300Lx、500Lx条件下，在最适温度下进行培养7天。每个水平接20个平板，观测菌丝的长势以菌落直径，确定5406放线菌生长的适宜的光照条件。

1.2.4.3 5406放线菌生长适宜空气相对湿度的确定：按照优化出的高氏1号加富培养基最适配方制作平板培养基，每个平板中接104/mL孢子悬浮液0.1mL，分别放置于空气湿度为40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%条件下，在最适温度和光照条件下进行培养7天。每个水平接20个平板，观测菌丝的长势以菌落直径，确定5406放线菌生长的适宜的光照条件。

2 结果与分析

2.1 高氏1号加富培养基（碳源、氮源、维生素）单因素试验结果

2.1.1 高氏1号碳源加富培养基的筛选

图1 5406放线菌在高氏1号不同碳源加富培养基上生长情况

试验结果见图1。试验结果表明，在高氏1号基础培养基中添加不同的供试碳源5406放线菌菌丝生长速度的影响是不同的。从图1中可以看出5406放线菌在添加麦芽糖加富培养基上菌丝生长最快，接种7天后菌落直径达到6.35mm，比对照培养基上菌落直径大2.73mm，观察菌落表面特征，菌丝呈白色，致密；其次是在蔗糖和葡萄糖加富培养基上生长较快，菌落直径分别比对照培养基上菌落直径大1.84mm和1.56mm，菌落表面白色，较致密；以乳糖为碳源加富培养基上菌落生长速度最慢，接种7天后菌落直径达到4.54mm，比对照培养基上的菌落直径大0.92mm，菌落表面白色，较致密。因此，通过试验筛选出高氏1号碳源加富培养基为麦芽糖，其次为蔗糖和葡萄糖，生长最慢的为乳糖。

2.1.2 高氏1号氮源加富培养基的筛选

图2 5406放线菌在高氏1号不同氮源加富培养基上生长情况

试验结果见图2。试验结果表明，在高氏1号基础培养基中添加不同供试氮源，对5406放线菌菌落生长速度的影响是不同的。从图2中可以看出5406放线菌在添加牛肉膏氮源加富培养基上菌丝生长最快，接种7天后菌落直径达到6.16mm，比对照培养基上菌落直径大2.54mm，观察菌落表面特征，菌丝呈白色，致密；其次是在蛋白胨和酵母膏氮源加富培养基上生长较快，菌落直径分别比对照培养基上菌落直径大1.60mm和1.55mm，菌落表面白色，较致密；在（NH4）2SO4氮源加富培养基上菌落生长速度最慢，与对照相近，接种7天后菌落直径达到3.86mm，只比对照培养基上的菌落直径大0.24mm。因此，通过试验筛选出高氏1号氮源加富培养基为牛肉膏，其次为蛋白胨和酵母膏药，而（NH4）2SO4氮源加富培养基生长上菌落生长最慢。

2.1.3 高氏1号维生素加富培养基的筛选

图3 5406放线菌在高氏1号不同维生素加富培养基上生长情况

试验结果见图3。试验结果表明，在高氏1号基础培养基中添加不同供试维生素，5406放线菌菌落生长速度的影响是不同的。从图3中可以看出，5406放线菌在添加VB1加富培养基上菌落生长最快，接种7天后菌落直径达到6.24mm，比对照培养基上菌落直径大2.62mm，观察菌落表面特征，菌丝呈白色，致密；其次是在VB12加富培养基上生长较快，菌落直径分别比对照培养基上菌落直径大2.25mm，在VB6加富培养基上菌落直径比对照培养基上菌落直径大1.84mm；在VB2加富培养基上菌落生长速度最慢，比对照培养基上菌落直径大1.23mm；因此，通过试验筛选出高氏1号维生素加富培养基为VB1，其次为VB12，在VB2加富培养基生长上菌丝生长最慢。

2.2 高氏1号加富培养基最适配方的确定

试验结果见表3。由表3可知，不同组合之间5406放线菌菌落生长速度是不同的，以A3B2C1D3组合放线菌菌落的生长速度最快，菌落的平均直径为6.64mm，菌落表面为白色，菌落表面致密，长势好。从极差分析结果可以看出，对5406放线菌生长速率影响的排序为麦芽糖＞pH＞VB1＞牛肉膏，通过试验确定高氏1号加富培养基最适配方为可溶性淀粉20g、麦芽糖15g、牛肉膏4g、B120.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL0.5g、琼脂 18g、H2O1000mL、pH 为 7.5。

表3L9（34）正交试验结果

2.3 5406放线菌生长环境条件的单因素试验结果

2.3.1 5406放线菌生长适宜温度的确定

图4 不同温度对5406放线菌生长的影响

试验结果见图4。由图4可知，5406放线菌菌落随着温度的升高，生长速度逐渐加快，在35℃下生长速度最快，培养7天菌落直径达6.35mm，菌落表面白色致密，长势好，当超过35℃时，生长速度逐渐下降，当温度达到45℃时，培养7天的菌落直径为3.24mm，菌落表面菌丝稀疏，长势差。由此可知，5406放线菌生长的适宜温度为35℃。

2.3.2 5406放线菌生长适宜空气相对湿度的确定

图5 不同空气相对湿度对5406放线菌生长的影响

试验结果见图5。由图5可知，5406放线菌菌落随着空气相对湿度的升高，生长速度逐渐加快，当空气相对湿度达到60%时，生长速度最快，培养7天菌落直径达6.54mm，菌落表面白色致密，长势好；当空气湿度超过60%时，菌落的生长速度逐渐下降，特别是空气湿度达到80%时，平板培养基污染较重，表明5406放线菌不宜在高湿条件下培养，最适的空气相对湿度为60%左右。2.3.3 5406放线菌生长的适宜光照条件的确定

试验结果见图6。由图6可知，5406放线菌菌落在无光或弱光条件生长速度较快，随着光照的增强，生长速度逐渐下降。观察菌落表面特征，在无光或弱光条件下菌落致密，较厚，长势好；当光照达到300Lx后，菌落薄，长势较差。

图6 不同光照强度对5406放线菌生长的影响

3 结论与讨论

3.1 在高氏1号碳源加富培养基的筛选试验中，从理论上看葡萄糖作为单糖要比双糖更容易被吸收，但本研究中在高氏1号基础培养基中加入麦芽糖为速效碳源时，5406放线菌菌落生长速度最快，长势最好，说明麦芽糖更易于5406放线菌吸收利用；进行高氏1号氮源加富培养基筛选时，试验结果证明有机氮源有利于5406放线菌吸收和利用，特别是牛肉膏氮源加富培养基，菌落的生长的较快，长势好，而在高氏1号基础培养基中加入无机氮源（NH4）2SO4时，菌落的生长速度与对照相近，说明5406放线菌对无机氮源吸收利用不充分；在高氏1号维生素加富培养基筛选试验中，添加不同的维生素时5406放线菌与对照相比较均有促进作用，添加VB1和VB12时效果最佳。

3.2 试验结果表明，所用的高氏1号加富培养基与高氏1号基础

培养基（对照）相比，均能够促进5406放线菌的生长，但通过正交试验筛选出适合5406放线菌生长的高氏1号加富培养基配方为可溶性淀粉20g、麦芽糖15g、牛肉膏4g、B10.1g、KNO33g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、NaCL 0.5g、琼脂 18g、H2O1000mL、pH为7.5。该配方与高氏1号基础培养基相比，营养更充分，更有利于5406放线菌的生长。

3.3 5406放线菌生长不仅需要充足的营养条件，还需要适宜的环境条件。为了确定5406放线菌生长适宜的环境条件，本试验对温度、光照、空气相对湿度进行了单因素试验研究。试验结果表明，5406放线菌生长适宜的环境条件为适宜温度为35℃，适宜的空气相对湿度为60%左右，在无光或弱光条件下生长快，菌落较厚，表面致密，长势好。

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