植物病原菌种资源库在实验教学中的应用

孔令广 董 会 王庆佶 刘灵芝

山东农业大学植物保护学院 山东泰安 271018

植物病原菌种资源库是植物病理学实验课程的重要教学载体，是实践教学的基础，也是理论联系实际的重要桥梁[1]。病原菌资源的种类多少和质量的好坏直接影响着植物病理学实验教学的效果[2]。菌种库成为制约实验教学改革、发展的瓶颈。建立具一定规模的植物病原菌种资源库对进一步深化本科教学改革，加强教学实践环节，全面提高教学质量起到至关重要的作用，是每位实验教学教师应该认真考虑和着手开展的工作[3]。

随着“互联网+”和分子生物学技术的快速发展，植物病理学研究进入一个新的时代[4]。目前，越来越多的高校根据学科发展需要，在本科阶段安排了分子植物病理学相关实验，如植物病原菌基因组的提取，通过核酸序列鉴定植物病原菌的种类，植物病原菌的遗传转化等，这些实验安排既便于操作，又能体现分子植物病理学的创新内涵，使得学生能通过实验教学及时地理解并掌握分子植物病理学发展的前沿理论知识[5]。为适应新的实验教学内容，新构建植物病原菌基因组库，为分子生物实验教学提供素材，推动实验内容的教学改革。

1 植物病原菌种资源库的整体布局

目前，山东农业大学植物保护实验教学中心(以下简称“实验中心”)正在积极构建自己的病原菌中资源库，主要从图1所示的几方面进行。

图1 植物病原菌种资源库的构建示意图

2 植物病原菌种资源库的具体内容

2.1 病原菌种库构建

立足本省，放眼全国，对山东省及国内主要植物病害的病原菌进行分离培养和鉴定、保存。植物病原真菌获得采用组织分离法[6]，获得的菌株通过显微镜检或分子生物学技术鉴定、命名，并用无菌水在4 ℃冰箱保存或者在适宜的固体斜面培养基低温保存。植物病原细菌采用划线法和稀释法获得单一菌落，通过革兰氏染色或分子生物学技术鉴定、命名，常用50%甘油和菌液 1:1 混合，混匀后-80 ℃冰箱中保存[7]。实验中，每位学生分离一种固定病害，检验学生对本节实验技能掌握情况。同时，还要求每位学生根据自己兴趣爱好，额外选择一种病害进行分离培养，这样既增加菌种数量，也大大开拓了学生的眼界，丰富了实验内容。中心除了自己分离病原菌外，还可与其他院校开展病原菌种交流活动，互换南北各地特色菌株，来丰富和完善现有的植物病原菌种。

2.2 菌落形态图库构建

利用高清数码相机将上述分离培养的病原菌的菌落的形态、颜色、菌丝的密集和稀疏等特点进行拍摄，菌落特征的文字描述增加相应的图片库，图文并茂，填补实验中心病原菌菌落形态图库的空白，使枯燥的文字描述，变得生动形象，便于学生理解和掌握。新构建的菌落图库为将来学生独立开展病原菌鉴定具有重要的指导意义。例如，学生在分离果树病害时，就可以通过菌落形态和颜色进行初步鉴定：苹果树的腐烂病原菌在PDA培养基上，初期为白色，后期为褐色，正面气生菌丝减少，而且会产生多个子实体。而苹果树轮纹病菌在PDA培养基上，初期为白色浓密的绒毛菌丝，然后菌落颜色逐渐从中心点向四周变成青色，最后变成墨绿色，而且黑暗条件下，不易形成分生孢子器。通过这些典型的病原菌菌落特征，学生就可以对分离的微生物进行快速初步鉴定，大大提高了实验效率。另外，教师也通过积累获得完全具有自己知识产权菌落图片，可用于实验教学及出版各类教材。

2.3 玻片标本库构建

将分离的病原菌制作成结构典型、完整清晰的切片。选取植物病害的典型病，如霉状物(草莓灰霉病等)、粉状物(玉米瘤黑粉)、霜状物(黄瓜霜霉病等)、锈状物(小麦叶锈病等)、颗粒状物(苹果炭疽病等)等，在实验室可采用“挑、撕、刮、贴、切”等方法将病原菌结构制成临时玻片。质量好的典型结构的需经固定、染色、脱色等步骤制成永久玻片。目前，实验中心已保存常见植物病害玻片300余种，2000多片，并按病原菌或寄主命名，便于教师和学生查看，丰富了实验教学资源。

2.4 数字切片库构建

利用Motic全自动扫描显微系统将上述玻片扫描成数字切片，存储在计算机内，按病原菌或寄主命名，便于教师、学生查询和学习。制作数字切片时，先命名要扫名的切片和选择存储路径，然后利用Motic全自动扫描显微系统在4X物镜下对玻璃切片进行快速扫描获得扫描地图，此时，得到的是玻片标本的名称和目标图片的大体位置。然后找到所需要的目标后转到高倍物镜下建模，建模完成后自动扫描，相应的扫描控制软件将扫描的切片自动进行无缝拼接和处理，存储并建立数字切片库。目前，扫描植物病害玻片300余种，这些病害已按寄主名称如大田作物、经济作物、果树、蔬菜、林木、花卉等进行分类，也有的是按病原菌分类如卵菌、接合菌、子囊菌、担子菌、半知菌，满足农业病理学实验和普通植物病理学实验等课程的不同需求。教师和学生可以随时登录山东农业大学植物保护实验教学中心的数字切片库网站进行浏览学习，学生“时时学，处处学”变得可行，极大拓宽了学生获取知识的渠道，锻炼了学生自主学习的能力。

2.5 病原菌的基因组库建立

将上述分离纯化的病原菌，筛选重要和具有研究价值的病原菌，分别用真菌基因组DNA提取试剂盒(Fungle Genomic DNA Kit)、细菌基因组提取试剂盒(Bacteria Genomic DNA Kit)、病毒RNA提取试剂盒(RNApure Virus Kit)以及RT-PCR反转录试剂盒提取病原菌的基因组，具体操作参照各自说明书。最后将提取的基因组DNA或合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中，RNA要保存于-80 ℃冰箱。学生通过实验提高了动手能力，培养了科研能力和创新精神。同时，为开展病原菌的分子鉴定，病原菌致病基因的克隆和功能分析等分子生物学实验项目提供素材。

3 结语

病原菌种资源库的构建，有利于培养学生动手能力，训练其扎实的实验基本功，为以后独立开展植物病害的相关工作奠定了良好的基础。建立病原菌的基因组库和信息资源库符合学校“利用现代生物技术和计算机技术提升传统学科”的教学规划。菌种资源库的建立从根本上改变传统单调的教学模式，深化了实验教学改革，合理的配置教学资源，提高了实验教学质量。

[1]杨媚.植物病害标本在教学改革中的地位和作用研究[J].安徽农业科学,2014,42(5)1583-1584.

[2]王文龙,呼和巴特尔,杨晓野,王瑞,刘珍莲,陆静.兽医寄生虫标本资源库建设及其在教学中的应用[J].现代农业科技,2013(6):336-337.

[3]梁元存,竺晓平,李壮,张修国,杨广玲,赵春青,刘玉升.《普通植物病理学》实验教学改革[J].实验科学与技术,2014,12(2):149-151.

[4]常有宏,张磊,刘邮洲.植物病原真菌PCR 检测技术研究进展[J].江苏农业科学,2012,40(2):89-93.

[5]张铉哲,冉隆贤,李永刚,廖晓兰,易图勇,张俊华.植物病理学研究技术[M].北京:北京大学出版社,2015.

[6]全国高校微课教学比赛.[EB/OL].http://weike.enetedu.com/play.asp?vodid=189184&e=14.

[7]许志刚.普通植物病理学实验实习指导[M].北京:高等教育出版社,2008:5-9,70-79.