常见海洋细菌对纳米二氧化钛的响应

陈嘉祥,王兆守*,邵宗泽

(1.厦门大学化学化工学院,福建 厦门 361005;2.国家海洋局第三海洋研究所,国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室,福建 厦门 361005)

纳米材料因具有小尺寸效应、表面效应、界面效应和量子隧道效应等独特的物理性质,表现出很多优异、全新的功能,进而被大量生产并广泛应用于各个领域[1-2].TiO2具有良好的光催化特性,可杀灭细菌,还具有良好的热稳定性和耐化学腐蚀性,因此,被广泛应用于杀菌、颜料、涂料、化妆品、电子材料、食品添加剂、药品以及生物医学和工业生产等领域[3-5].纳米TiO2是商业化生产最早、产量最高、应用范围最广的纳米材料之一.2011—2014年世界商业生产的纳米TiO2每年超过1 万t[6].由于其高产量和高使用频率,不可避免地会进入到海洋水体等生态环境中,其潜在的生态风险和对人类健康的影响已引起人们的广泛关注.尽管目前有关环境中纳米TiO2污染的研究还比较少,但已有研究表明纳米TiO2可通过浸出和排放等形式进入地表水[6].

纳米TiO2对部分水生生物有毒性作用.Ozaki等[7]在研究纳米TiO2对人造水系沉积物中细菌群落丰度、活性和群落组成的影响后发现,纳米TiO2的添加会导致细菌群落丰度快速下降.Zheng等[8]研究了纳米TiO2颗粒对活性污泥的长期影响,发现活性污泥的表面结构没有破损,这可能是活性污泥分泌的胞外多糖起到了保护作用,但是污水中50 mg/L 的纳米TiO2颗粒显著改变了活性污泥微生物的多样性并且显著降低了硝化菌的数量.另外,有学者研究了纳米TiO2对大肠杆菌(Escherichiacoli)[9]、微藻[10]、水蚤、轮虫和植物细胞[11]的毒性影响,然而纳米TiO2对常见海洋细菌的影响尚未有系统的研究报道.为此,本文中选择6种常见海洋细菌,研究其对纳米TiO2的响应,以期为环境和生态系统的安全提供早期的预警,为应对水产品安全及资源环境问题提供科学支撑.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株及培养基

本研究所用的菌株：海杆菌(Marinobactersp.) MCCC 1A00092,与M.hydrocarbonoclasticus相似性为94.64%,分离自泉州市近海海域;盐单胞菌(Halomonassp.)MCCC 1A00533,与H.meridiana相似性为100%,分离自东太平洋海域;交替单胞菌(Alteromonassp.)MCCC 1A00576,与A.australica相似性为99.69%,分离自东太平洋海域;副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)MCCC 1A02609,分离自日本海域.均在中国海洋微生物菌种保藏中心(MCCC)保存.聚球藻(Synechococcussp.) XM-24和299,分别分离自厦门市近海海域和台湾岛近海海域,由厦门大学海洋与地球学院郑强博士提供.枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)MCCC 1A00693和大肠杆菌CICC 10389,作为革兰氏阳性和阴性模式菌,分别由MCCC和陈新华研究员课题组提供.

大肠杆菌采用LB培养基,聚球藻XM-24与299采用BG11培养基[12],其余细菌均采用2216E培养基.

1.1.2 试剂及仪器

纳米TiO2(粒径25 nm,Acros,美国)，T25细胞培养瓶、50 mL离心管和0.22 μm滤膜(美吉公司，上海).

能谱(EDS)分析仪和扫描电子显微镜(SEM)(Zeiss Sigma,德国),微生物生长曲线测定仪(AB Ltd,芬兰),核酸蛋白测定仪(Biorad,美国),荧光显微镜(Nikon,日本).

1.2 实验方法

1.2.1 纳米TiO2母液的配制及表征

配制10 mg/mL的纳米TiO2母液:称取纳米TiO2粉末,加入一定量超纯水,121 ℃高压灭菌20 min后,超声30 min.

表征:取一定量的纳米TiO2粉末加入到5 mL超纯水中,经超声分散后用毛细吸管吸取少量溶液滴加在洁净的硅片上,在60 ℃烘箱中干燥,然后进行EDS和SEM分析.

1.2.2 菌体的活化与培养及生长指标的测定

1) 非光合细菌

将保存的菌种转接到液体培养基中,适宜条件下培养24 h,取一定量菌液在固体培养基上活化培养24 h,再将新平板中单菌落挑取至相应液体培养基,适宜条件下培养至对数生长期,待用.在锥形瓶中各加100 mL培养基,灭菌后加菌液使其初始浓度约为1×106mL-1,再添加纳米TiO2母液,使纳米TiO2终质量浓度分别为0(对照组),0.1,1,10,100 mg/L,每个质量浓度设6个重复.在适宜温度下(海杆菌和枯草芽胞杆菌为28 ℃,盐单胞菌和交替单胞菌为20 ℃,副溶血弧菌为30 ℃,大肠杆菌为37 ℃),转速120 r/min,分别在无光照和光照1 000～1 500 lx的条件下振荡培养.

光照条件下培养的细菌,每隔6 h取样,以相应质量浓度的纳米TiO2(不含菌体)溶液为空白对照，采用核酸蛋白测定仪测定其在600 nm下的吸光度(A600)[13],并在光学显微镜下利用血球计数板进行计数.采用微生物生长曲线测定仪测定无光照条件下培养的细菌的生长曲线(以A600表示).

2) 光合细菌

将5 mL聚球藻液加入到含30 mL BG11培养基的T25细胞培养瓶中,光照1 000～1 500 lx,室温25 ℃,光周期为12 h光照/12 h黑暗,培养7 d.在每天早10：00和晚10：00各摇匀2次,培养藻液至对数生长期,待用[14].通过A680值进行估算,将藻液稀释至约5×107mL-1,取1 mL加入到50 mL BG11培养基中,加入纳米TiO2母液使纳米TiO2终质量浓度分别为0(对照组),0.1,1,10,100 mg/L,每个质量浓度设3个重复,在上述光照及温度下连续培养.每隔3 d取样1次,共4次.每瓶每次取藻液1 mL用于测定A680,取500 μL用于荧光显微镜计数,剩余藻液用于测定叶绿素a含量[15-16].

1.3 统计与分析

采用R软件对实验结果进行单因素方差分析(One-way ANOVA),p<0.05表示差异显著,p<0.01表示差异极显著.

2 结 果

2.1 纳米TiO2的表征

图1为对纳米TiO2元素组成和粒径大小的表征结果.由图1(a)可知,样品含有Ti、O、C 3种元素,其中少量的C可能是制备纳米TiO2过程中钛酸四正丁酯(Ti(OC4H9)4) 水解产生的残余.如图1(b)的SEM结果所示,该纳米TiO2的粒径约为25 nm.

图1 纳米TiO2的EDS(a)和SEM(b)图Fig.1 EDS spectrum(a) and SEM image(b) of nano-TiO2

2.2 纳米TiO2对海杆菌生长的影响

(a)核酸蛋白测定仪测定；(b)细胞计数；(c)生长曲线测定仪测定.图2 纳米TiO2对海杆菌生长的影响Fig.2 Effect of nano-TiO2 on the growth of Marinobacter sp.

在光照培养下，纳米TiO2对海杆菌生长影响的实验结果如图2(a)和(b)所示:经过18 h的光照培养,海杆菌对照组的生物量最高,其余各处理组的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01);经过24 h的光照培养,100 mg/L处理组的生物量最低,菌体生长受到明显抑制,与对照组和其余各处理组的差异极显著(p<0.01).

如图2(c)所示,在无光照培养下,取15 h(对数期)生长速率和20 h(稳定期)生物量增加量的数据进行统计学检验,可见100 mg/L处理组海杆菌的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01).由于纳米TiO2常温下不溶于水,会产生光吸收,当纳米TiO2质量浓度较高时,细胞可能与TiO2相互吸附、沉降,导致吸光度下降;而在数据分析时以相应质量浓度纳米TiO2溶液(不含菌体)的光密度为空白对照,导致生长曲线中处理组在细菌生长停滞期的光密度为负值.

2.3 纳米TiO2对盐单胞菌生长的影响

纳米TiO2对盐单胞菌生长影响的实验结果见图3.如图3(a)和(b)所示:经过18 h的光照培养,盐单胞菌生物量以对照组最高,各处理组的菌体生长受到显著抑制(p<0.05);经过24 h的光照培养,100 mg/L处理组的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01).如图3(c)所示,在无光照培养下,分析对数期(10 h)生长速率和稳定期(22 h)生物量增加量,可见100 mg/L处理组的盐单胞菌生长受到极显著抑制(p<0.01).

2.4 纳米TiO2对交替单胞菌生长的影响

纳米TiO2对交替单胞菌生长影响的实验结果见图4.如图4(a)和(b)所示:经过18 h的光照培养,各处理组的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01);经过24 h的光照培养,100 mg/L处理组的生物量最低,菌体生长受到极显著抑制(p<0.01).如图4(c)所示,在无光照培养下,100 mg/L处理组的交替单胞菌对数期(5 h)的生长速率最低,可见菌体生长受到极显著抑制(p<0.01).

2.5 纳米TiO2对副溶血弧菌生长的影响

(a)核酸蛋白测定仪测定；(b)细胞计数；(c)生长曲线测定仪测定.图3 纳米TiO2对盐单胞菌生长的影响Fig.3 Effect of nano-TiO2 on the growth of Halomonas sp.

(a)核酸蛋白测定仪测定;(b)细胞计数;(c)生长曲线测定仪测定.图4 纳米TiO2对交替单胞菌生长的影响Fig.4 Effect of nano-TiO2 on the growth of Alteromonas sp.

(a)核酸蛋白测定仪测定;(b)细胞计数;(c)生长曲线测定仪测定.图5 纳米TiO2对副溶血弧菌生长的影响Fig.5 Effect of nano-TiO2 on the growth of V. parahaemolyticus

纳米TiO2对副溶血弧菌生长影响的实验结果见图5.如图5(a)和(b)所示:分别经过6和12 h的光照培养,100 mg/L处理组的副溶血弧菌生物量与其他处理组出现显著差异,菌体生长受到极显著抑制(p<0.01);0.1 mg/L的纳米TiO2对副溶血弧菌的生长不但没有抑制作用,反而有一定的促进作用(图5(a));经过24 h的光照培养,高质量浓度(10和100 mg/L)处理组的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01)(图5(b)).如图5(c)所示,在无光照培养下,稳定期(15 h)时10和100 mg/L处理组的副溶血弧菌生物量增加量均降低，可见菌体生长受到显著抑制(p<0.05).

2.6 纳米TiO2对大肠杆菌生长的影响

纳米TiO2对大肠杆菌生长影响的实验结果见图6.如图6(a)和(b)所示:经过18 h的光照培养,100 mg/L处理组的大肠杆菌生物量最低,菌体生长受到显著抑制(p<0.05),10 mg/L处理组的菌体生长也受到显著抑制(p<0.05)；经过24 h的光照培养,100 mg/L处理组的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01).如图6(c)所示,在无光照培养下,对数期(5 h)处理组的生物量与对照组无显著差异(p>0.05);稳定期(15 h)100 mg/L处理组的菌体生长受到显著抑制(p<0.05).

2.7 纳米TiO2对枯草芽胞杆菌生长的影响

(a)核酸蛋白测定仪测定;(b)细胞计数;(c)生长曲线测定仪测定.图6 纳米TiO2对大肠杆菌生长的影响Fig.6 Effect of nano-TiO2 on the growth of E. coli

(a)核酸蛋白测定仪测定;(b)细胞计数;(c)生长曲线测定仪测定.图7 纳米TiO2对枯草芽胞杆菌生长的影响Fig.7 Effect of nano-TiO2 on the growth of B. subtilis

纳米TiO2对枯草芽胞杆菌生长影响的实验结果见图7.如图7(a)和(b)所示:经过18 h的光照培养,1 mg/L处理组的枯草芽胞杆菌生物量最高,此时纳米TiO2不但没有抑制作用,反而有显著促进菌体生长的作用(p<0.05);经过24 h的光照培养,对照组的生物量最高,各处理组的菌体生长受到显著抑制(p<0.05),其中100 mg/L处理组的生物量最低,菌体生长受到极显著抑制(p<0.01).如图7(c)所示,在无光照培养下,无论处于对数期(12 h)或稳定期(20 h),100 mg/L处理组的菌体生长均受到极显著抑制(p<0.01).

2.8 纳米TiO2对聚球藻生长的影响

纳米TiO2对聚球藻299生长影响的实验结果见图8.经过6 d的培养,处理组与对照组、各处理组间均存在显著差异(p<0.05)(图8(a));经过9 d的培养,高质量浓度(10和100 mg/L)处理组的菌体生长受到显著抑制(p<0.05);经过12 d的培养,100 mg/L处理组的菌体生长受到极显著抑制(p<0.01);此外,在培养的中后期(9～12 d),0.1 mg/L的纳米TiO2对聚球藻299的生长不但没有抑制作用,反而有显著促进生长的作用(p<0.05)(图8(b)).

通过测定叶绿素a含量(图8(c))发现:经过6 d的培养,0.1 mg/L处理组菌体的叶绿素a含量显著升高(p<0.05);经过9 d的培养,100 mg/L处理组菌体的叶绿素a含量显著降低(p<0.05);经过12 d的培养,各处理组间菌体叶绿素a含量无显著差异(p>0.05).可见低质量浓度纳米TiO2处理在短时间内会促进叶绿素a的合成,但当聚球藻299逐渐适应该质量浓度纳米TiO2时,叶绿素a的合成反而略被抑制,因此其含量降低.

(a)核酸蛋白测定仪测定OD680;(b)细胞计数;(c)叶绿素a含量测定.图8 纳米TiO2对聚球藻299生长的影响Fig.8 Effect of nano-TiO2 on the growth of Synechococcus sp. 299

(a)核酸蛋白测定仪测定OD680;(b)细胞计数;(c)叶绿素a含量测定.图9 纳米TiO2对聚球藻XM-24生长的影响Fig.9 Effect of nano-TiO2 on the growth of Synechococcus sp. XM-24

与纳米TiO2对聚球藻299生长影响的结果类似,纳米TiO2对聚球藻XM-24生长影响的实验结果见图9.如图9(a)和(b)所示,经过6 d的培养,处理组聚球藻XM-24的生物量随纳米TiO2质量浓度的升高而显著降低(p<0.05);经过9～12 d的培养,高质量浓度(10和100 mg/L)处理组的菌体生长受到显著抑制(p<0.05).在培养后期(12 d),高质量浓度(10和100 mg/L)处理组的叶绿素a含量显著降低(p<0.05)(图9(c)).

3 讨 论

本研究表明,高质量浓度(100 mg/L)纳米TiO2对海杆菌、盐单胞菌、交替单胞菌、副溶血弧菌4种常见海洋非光合细菌，光合细菌聚球藻XM-24和299以及枯草芽胞杆菌和大肠杆菌2种模式细菌的生长均产生显著的抑制作用(p<0.05);而低质量浓度(0.1和1 mg/L)纳米TiO2未有显著抑制作用,其中,0.1 mg/L纳米TiO2对聚球藻299和副溶血弧菌的生长有一定促进作用，1 mg/L纳米TiO2对枯草芽胞杆菌的生长有一定促进作用.纳米TiO2对非光合细菌生长的抑制一般在18 h后显著显现(p<0.05);而对2种聚球藻生物量的影响则在6 d之后较为显著(p<0.05).

Erdem等[17]研究表明,纳米TiO2毒性与其粒径大小有关,粒径小于40 nm时其抑菌能力较强,且粒径越小抑菌效果越明显.Priyanka等[18]提出纳米材料抑菌作用是在光照条件下完成的.本研究结果显示,无论光照与否,在一定质量浓度范围内,纳米TiO2对细菌均有一定抑制作用,这表明光照并非是纳米材料抑菌的必要条件.但本文中并未比较光照与非光照条件对细菌抑制作用的大小,这有待进一步研究.

本研究表明，高质量浓度(10和100 mg/L)纳米TiO2对常见海洋细菌的影响显著,这与已有的非海洋细菌的研究结果类似.Priyanka等[18]的研究表明质量浓度大于100 mg/L的纳米TiO2在光照条件下对大肠杆菌MTCC 443和枯草芽胞杆菌MTCC 10619产生抑制作用.Erdem等[17]的研究表明,质量浓度为100～1 000 mg/L的纳米TiO2会损伤大肠杆菌K12 25254和枯草芽胞杆菌39706的细胞膜,有抑菌效果,且抑菌效果随其质量浓度的增大而增大.Pop等[19]的研究结果也表明纳米TiO2的抑菌效果随其浓度的增大而增大.Karunakaran等[20]的研究显示,高浓度纳米TiO2会抑制土壤中荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和短芽胞杆菌(B.brevis)的生长.孔彬彬等[21]的研究表明,低浓度纳米TiO2对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)、乳酸杆菌(Lactobacillus)等细菌几乎没有抑制作用.本研究还发现,低质量浓度(0.1和1 mg/L)的纳米TiO2对部分海洋细菌生长有一定的促进作用,但是,一定时间后,当细菌逐渐适应该质量浓度纳米TiO2时,其生长反而会被抑制,因此其生物量会下降.低质量浓度纳米TiO2对某些细菌生长有促进作用的原因有待进一步研究.

聚球藻作为海洋中常见光合细菌的代表,叶绿素a含量的变化可反映出细胞代谢活力的变化.因此,选用测定叶绿素a含量作为衡量细胞活性的方法之一.从本研究结果来看,纳米TiO2对聚球藻XM-24叶绿素a的含量并未有显著影响；对聚球藻299,在培养中后期也只有100 mg/L纳米TiO2才使叶绿素a含量显著降低(p<0.05),但在培养中期(6 d),0.1 mg/L纳米TiO2对叶绿素a的合成有显著促进作用(p<0.05).这表明纳米TiO2的抑菌作用可能不影响叶绿素a的合成,并且可能因细菌种类而异.陈宇婷等[15]研究表明,低质量浓度纳米氧化铁对聚球藻生长并无抑制作用,对细胞内物质不表现刺激作用.而本研究表明,低质量浓度纳米TiO2对聚球藻生长并无抑制作用,甚至还有一定的促进作用.这与非海洋微生物的研究结果一致:成婕等[22]研究表明,低质量浓度(<5 mg/L)纳米TiO2可促进斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)生长并促进叶绿素 a的合成,而高质量浓度(>10 mg/L) 则具有抑制作用.纳米材料的抑菌机制,可能是由纳米材料释放出活性氧破坏细胞壁和细胞膜所致；或者纳米材料直接进入细胞,通过释放金属离子,产生氧化胁迫作用,并对DNA产生损害,进而起到抑菌的作用[19].目前国内外对不同纳米材料的抑菌机制还没有定论,有待于进一步深入研究.

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