不同生霉粒小麦中呕吐毒素含量的变化

刘　双　马玉侠

山东中储粮粮油质监中心　济南　250000

小麦的不完善粒包括：虫蚀粒、病斑粒（黑胚粒和赤霉病粒）、破损粒、生芽粒、生霉粒。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又称呕吐毒素DON，主要是由镰刀菌的某些种产生的化学结构和物理活性相似的有毒代谢产物——单端孢霉烯族化合物的一种[1]。DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与其它的霉菌毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用[2]。近年来发现DON可能与人类食道癌、肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国谷物中DON的限量标准为1.0mg/kg[3]。

2017年夏季，特别是小麦收割前后，山东地区持续降雨、气温多变，多地小麦倒伏现象严重，导致收获小麦水分偏高，此种条件较适合微生物生长、繁殖。随后气温上升导致絮叨小麦发热、生霉、产毒。

相关研究表明，小麦赤霉病发病程度和籽粒中呕吐毒素含量密切相关，病小麦穗率高则呕吐毒素含量也高，反之亦然[4]。但小麦的生霉粒与籽粒中呕吐毒素含量关系研究较少。本实验采用不同生霉粒含量的小麦进行呕吐毒素检测，分析小麦生霉粒含量与呕吐毒素含量的关系。

1　材料与方法

1.1　　仪器与试剂

WatersE2695高效液相色谱仪；呕吐毒素标准品100μg/mL，购于北京华安麦科；甲醇，色谱纯，购于美国Honey-well公司；呕吐毒素免疫亲和柱，购于北京华安麦科；聚乙二醇，相对分子量8000；样品处理及溶剂配制使用实验室一级水。

1.2　　色谱条件

色谱柱：watersC18柱，150 mm×4.6 mm，5μm；流动相：甲醇∶水（20∶80）；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：50μL；检测波长：218 nm。

1.3　　标准曲线的绘制

准确移取适量DON标准储备溶液（100μg/mL）用流动相稀释，配置成200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5000 ng/mL的标准系列工作液，4℃保存，有效期7天。在上述色谱条件下，将标准系列工作液由低到高浓度依次进样检测，分别测定其保留时间和峰面积。以脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，作出标准曲线图（图1），并得到标准曲线回归方程。测定结果表明，呕吐毒素在200～5000 ng/mL区间线性关系良好。

图1　呕吐毒素标准曲线

1.4　　样品的前处理

将样品研磨，使其粒度能通过1mm孔径的试验筛，不能研成粉末。称取样品25 g（准确到0.1 g）于100mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，用水定容至100mL，混匀，置于摇床上震荡20min。先以定量滤纸再以玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液。

事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。将其与玻璃注射器相连，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，准确移取2.0mL上述滤液至玻璃注射器中。调节下滴速度，控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入免疫亲和柱中。用5mL PBS缓冲盐溶液和5mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速每秒2滴，直至空气进入，并抽干小柱。准确加入2mL甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的速度，收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气吹至近干，加入1.0mL流动相溶解，并过0.45μm滤膜，收集滤液于进样瓶中，以备进样。

1.5　　检测的结果

我们对生霉粒分别为5%、10%、15%、20%、30%、40%、100%的小麦采用免疫亲和柱-高效液相色谱法进行呕吐毒素检测，测定的结果如图2所示，图3列出了其中生霉粒含量40%小麦的呕吐毒素出峰图。

图2　不同生霉粒含量小麦的呕吐毒素测定值

测定的结果表明不同生霉粒含量的小麦中的呕吐毒素含量虽然不同，但生霉粒百分比与呕吐毒素含量不成线性关系，即生霉粒百分比高的小麦样品中呕吐毒素含量不一定高。

图3　生霉粒含量40%小麦的呕吐毒素出峰图

2　分析与讨论

2.1　　色谱条件的选择

因甲醇极性较大，流动相中的甲醇和水的比例不同，色谱峰出现的早晚和峰形都会不同，甲醇比例低出峰延迟，比例高出峰提前。在考虑前期干扰峰和实验时间的前提下，选择甲醇:水为20:80作为流动相，比较合适。

2.2　　样品前处理的影响

在前期处理中，样品的粉碎程度对实验结果有一定影响。样品磨成粉末呕吐毒素检测的数据会低一些，因为其主要分布在种皮表面，小麦本身颗粒较大，加工得越细表面积越大，导致结果偏低，同时，样品碾磨过细也会造成过滤困难。

2.3　　结论

粮食含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂肪和无机盐等营养物质，是微生物生长所需的良好基质。一旦条件合适，一些微生物就会生长、繁殖，导致粮食发热、霉变，有的还产生毒素、直接影响储粮安全。从数据上看，小麦的生霉粒含量与呕吐毒素含量之间没有线性关系，不能说明生霉粒含量高的小麦呕吐毒素含量一定高。

虽然生霉粒含量高的小麦呕吐毒素不一定高，但是生霉小麦会对小麦粉加工、色泽气味及仓储保管会造成不利影响，建议收获、储存时尽量在低温、干燥、厌氧的条件下进行，防止小麦霉变。