酶解条件对火龙果甜菜红素含量和出汁率的影响

罗进，刘芳梅，赵雷，王凯，胡卓炎

（华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

火龙果(Hylocereus undatusBritt)又称红龙果、仙蜜果，是仙人掌科量天尺属和蛇鞭柱属植物，性喜温暖潮湿，耐炎热，原产于巴西、墨西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区[1]，近年在我国台湾、海南、广东和广西等地广泛种植。火龙果营养丰富，富含多种氨基酸和微量元素，深受消费者喜爱[2]。火龙果按其果皮果肉颜色主要分为红皮白肉、红皮红肉、黄皮白肉三大类，红皮红肉火龙果由于其果实中富含的甜菜红素具有抗氧化[3,4]、调节脂质代谢[5,6]和抗癌[7]等功能活性，近年来逐渐受到了人们的关注。

红肉火龙果主要以鲜销为主，但红肉火龙果不易贮藏，采摘后常温贮藏3 d，其鳞片出现黄化、萎蔫，果皮出现皱缩等现象[8]，严重影响了红肉火龙果的销售。红肉火龙果色素主要为甜菜红素，在火龙果果汁、果酱、果酒等产品加工和贮藏中，甜菜红素受加工参数如温度等条件的影响而发生降解，进而影响产品的质量。因此，研发富含甜菜红素的红肉火龙果加工产品，不仅能解决红肉火龙果腐烂造成的资源浪费，也能提高红肉火龙果加工产品的质量和附加值，具有重要意义。

目前红肉火龙果加工相关产品主要有火龙果酒[9]、火龙果汁[10]、火龙果干[11]和火龙果粉[12]等。关于红肉火龙果果汁的研究主要集中于复合果汁饮料配方[13,14]、果汁灭菌工艺的选择[15,16]、果汁澄清与护色工艺研究[17]等。酶法制备红肉火龙果澄清汁的工艺已有研究，但其主要侧重于果汁的出汁率等指标来确定最佳工艺[18,19]，并未考虑红肉火龙果在酶解工艺过程中其甜菜红素的影响。利用酶解处理红肉火龙果果浆，探讨不同酶解条件对红肉火龙果甜菜红素保留率、出汁率和澄清效果的影响，采用期望函数途径同时优化程序，以期获得甜菜红素保留率高、出汁率高和澄清效果好的红肉火龙果果汁产品。

1 材料与方法

1.1 实验材料

红肉火龙果(Hylocereus undatusBritt)，产地为广东省从化市；果胶酶（商品名为S10007，酶活力500 U/mg），上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WZ103糖度计，上海天呈科技有限公司；SHA-CA数显水浴恒温振荡器，常州普天仪器制造有限公司；UVmini-1240紫外分光光度计，日本岛津公司；TD5-Ⅱ低速离心机，长沙平凡仪器仪表公司；TA500质构测定仪，英国劳埃德仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

红肉火龙果→挑选→清洗→剥皮→破碎→加入果胶酶进行处理→钝化酶活性→快速冷却→压榨果汁→离心分离→火龙果澄清汁

1.3.2 酶法制备火龙果澄清汁单因素试验

1.3.2.1 酶添加量对制备火龙果澄清汁的影响

取50 g火龙果果浆6份，调节果浆pH至3.5，果胶酶添加量分别为0、100、200、300、400和500 U/g，混合均匀，于50 ℃水浴中酶解2 h。经80 ℃水浴保温5 min钝化酶活，分别测定出汁率、果汁透光率和甜菜红素含量。

1.3.2.2 酶解时间对制备火龙果澄清汁的影响

取50 g火龙果果浆6份，调节果浆pH至3.5，果胶酶添加量为300 U/g，混合均匀，于50 ℃水浴下分别酶解0、1、2、3、4和5 h。经80 ℃水浴保温5 min钝化酶活，分别测定出汁率、果汁透光率和甜菜红素含量。

1.3.2.3 酶解温度对制备火龙果澄清汁的影响

取50 g火龙果果浆5份，调节果浆pH至3.5，果胶酶添加量为300 U/g，混合均匀，选择酶解温度20、30、40、50、60 ℃进行试验，酶解2 h。经80 ℃水浴保温5 min钝化酶活，分别测定出汁率、果汁透光率和甜菜红素含量。

1.3.2.4 底物pH对制备火龙果澄清汁的影响

取50 g火龙果果浆5份，使用柠檬酸调节果浆pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，果胶酶添加量为300 U/g，混合均匀，于50 ℃水浴中酶解2 h。经80 ℃水浴保温5 min钝化酶活，分别测定出汁率、果汁透光率和甜菜红素含量。

1.3.3 酶解参数组合试验设计与优化

根据Box-Behnken试验设计，综合单因素试验所得结果，选取酶添加量、反应温度、底物pH 3个因素。以火龙果出汁率、果汁透光率、甜菜红素保留率为响应值，在单因素试验基础上，采用3因素3水平的响应面分析方法，运用期望函数同时优化多目标途径，确定酶法制备火龙果果汁的最佳工艺条件。试验因素和水平设置见表1。

表1 响应面因素水平设计表Table 1 Response surface level design table

1.3.4 出汁率测定

果汁出汁率的测定[20]：将火龙果果浆倒入 200目滤袋中，置于质构仪操作台上，质构仪设定固定压力400.00 N，压榨时间10 s，连续压榨两次。

1.3.5 果汁澄清度的测定

采用分光光度法[21]。火龙果果浆经酶解，钝化酶活性，冷却，压滤后，经3500 r/min离心20 min，取上清液。以蒸馏水为参照物，于660 nm测定透光率，用透光率T（%）表示果汁的澄清度。

1.3.6 果汁中甜菜红素的测定

参考Herbach[22]等人方法。取1 mL果汁于100 mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，摇匀，分别在波长 537 nm、600 nm处，以蒸馏水为空白参比，测定其吸光度。

式中：A为537 nm所测定的吸光度减去600 nm所测定的吸光度；Mw为甜菜红素的相对分子质量(Mw=550 g/mol)；DF为稀释倍数；ε为甜菜红素的摩尔吸收率(ε=60000 L/(mol·cm))；l为比色皿的厚度。

1.3.7 数据分析

试验重复三次，采用 IBM SPSS Statistics 20和SAS统计软件进行数据处理和统计分析，利用Duncan's均数差异显著性分析（p＜0.05），判断差异显著性。工艺优化运用期望函数同时优化多目标途径的方法[23]。

2 结果与讨论

2.1 酶解工艺参数对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响

2.1.1 酶添加量的影响

酶添加量对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响结果见图1。

图1 酶添加量对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响Fig.1 Effects of enzyme addition on the retention rate, juice yield and transmittance of betacyanin in red pitaya juice

由图1可知，对于果汁中甜菜红素变化，其含量随着果胶酶添加量的增加而显著减少（p＜0.05），且少量酶的加入便会引起甜菜红素的降解，这与甜菜红素不稳定有关。未经酶解的火龙果浆由于其含有高含量果胶，故其直接压榨所得果汁出汁率较低，仅能达到45.4±1.9%。果胶酶添加量对火龙果出汁率的提高有显著影响，在一定范围内，火龙果澄清汁的出汁率随果胶酶添加量的增加而显著升高(p＜0.05)，但在酶添加量达到300 U/g后，果汁出汁率无显著增加(p＞0.05)。这是因为在火龙果果浆一定时，其所含的果胶类物质的含量一定，过量的果胶酶只能加速酶解反应的进行，并不能提高出汁率。对于火龙果果汁的透光率，在添加少量果胶酶后果汁透光率显著升高(p＜0.05)，果汁品质得到提高；但当酶添加量达到300 U/g后，随着果胶酶添加量的继续增加，果汁的透光率会下降。这是因为果胶酶是一种蛋白酶，随着添加量的增加，果汁中酶蛋白含量增加，会使得果汁变浑浊[24]，可见果胶酶的过多添加并不益于果汁的澄清。综合单因素试验结果，选取酶添加量200～400 U/g进行下一步优化试验。

2.1.2 酶解时间的影响

酶解时间对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响结果见图2。

图2 酶解时间对对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响Fig.2 Effects of enzymolysis time on the retention rate, juice yield and transmittance of betacyanin in pitaya juice

由图2可知，果汁中的甜菜红素在酶解1 h后其保留率仅为 75.4±1.6%，随着酶解时间的延长，甜菜红素保留率持续下降，经5 h酶解后，其甜菜红素保留率仅为62.7±2.1%，为保证果汁中甜菜红素保留率，酶解时间不宜过长。当酶解时间小于2 h时，随着酶解时间的延长，火龙果澄清汁的出汁率迅速升高，当酶解时间大于2 h时，果汁出汁率提高缓慢。果汁透光率在酶解1 h后便可得到较大提高，但在2 h后，随着酶解时间延长，其透光率无显著差异(p＞0.05)。综合以上结果，选取酶解时间2 h左右较为合适。

2.1.3 酶解温度的影响

酶解温度对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响结果见图3。由图3可知，酶解温度对果汁中甜菜红素的含量有显著影响(p＜0.05)，随着酶解温度的升高，所得火龙果果汁中的甜菜红素含量逐渐下降，并在50 ℃后甜菜红素降解速率加快，这是因为甜菜红素为热不稳定色素，在加热条件下，甜菜红素的1号位氮原子处会发生水解反应，水解生成环多巴-5-葡萄糖苷和甜菜醛氨酸[25]，从而其生物活性降低。随着酶解温度的升高，果汁出汁率和透光率逐渐升高，其中火龙果出汁率在50 ℃达到65.0±0.7%，随着温度继续增加，当酶解温度高于50 ℃后，其出汁率和透光率开始下降。出汁率和果汁透光率的变化趋势与果胶酶的活性相关，在一定范围内，果胶酶活性随温度的升高而升高，并于50 ℃左右活性达到最高，随着温度继续升高，果胶酶开始发生变性，酶活力下降。综合单因素试验结果，选取酶解温度40～60 ℃进行下一步优化试验。

图3 酶解温度对对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on the retention rate,juice yield and transmittance of betacyanin in pitaya juice

2.1.4 底物pH的影响

底物pH对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响结果见图4。

由图4可知，果汁中甜菜红素在pH 4.5时保留率最高，达81.4±2.1%，当底物pH低于4.5时，随着pH的升高，果汁中甜菜红素的保留率逐渐升高，当底物pH高于4.5后，随着pH的升高，甜菜红素保留率开始下降。底物pH对火龙果出汁率和透光率有显著影响。在pH 3.5时，火龙果出汁率和透光率均达到最高，分别为65.0±0.7%和89.0±0.8%。出汁率和透光率的变化趋势与果胶酶的活性相关，底物pH会影响果胶酶的活性，从而对果汁的出汁率和透光率产生影响。权衡底物pH对火龙果果汁出汁率、透光率和甜菜红素保留率的影响，选取底物pH 3～4进行下一步优化试验。

图4 底物pH对对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响Fig.4 Effects of substrate pH on the retention rate, juice yield and transmittance of betacyanin in pitaya juice

2.2 酶解工艺参数与火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的响应曲面模型

根据单因素试验结果，选取酶解时间固定为2 h，酶添加量（%）、温度（℃）、pH三个因素不同水平对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响。利用统计软件进行响应曲面试验设计，试验方案及结果见表2。

利用统计软件对表2的数据经回归分析得到果汁甜菜红素保留率、出汁率和透光率的响应曲面模型，并对各响应变量模型进行失拟性与显著性检验，结果见表3。

结果表明，火龙果甜菜红素保留率Y1、出汁率Y2和透光率Y3的失拟性检验F1在 5%水平不显著（p＞0.05），说明模型无失拟性因素存在；而各响应曲面模型的显著性F2在1%水平显著（p＜0.01），说明各模型较好地拟合火龙果出汁率、透光率和甜菜红素保留率与三个参试因子之间的关系，模型的决定系数R2分别为0.9509、0.9896和0.9366。

表2 响应面设计及试验结果Table 2 Design and results of response surface methodology

7 0 -1 1 84.4 58.5 85.4 8 1 -1 0 76.1 59.6 86.3 9 -1 -1 0 81.7 59.1 85.5 10 0 0 0 72.2 64.8 89.7 11 0 0 0 73.9 65.6 89.9 12 -1 0 1 87.8 59.0 84.6 13 -1 1 0 57.2 56.1 88.5 14 1 0 -1 60.6 62.3 87.6 15 0 0 0 72.2 65.1 89.9 16 1 1 0 55.3 59.3 86.6 17 0 1 -1 53.9 58.2 88.1

表3 酶添加量、酶解温度和底物pH与火龙果甜菜红素保留率Y1、出汁率Y2和透光率Y3的响应面模型Table 3 The regression models of Y1 retention rate of betacyanin, Y2 juice yield, and Y3 juice transmittance with independent variables ofX1 enzyme concentration, X2 temperature and X3 substrate pH

2.3 酶解工艺各因素对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率影响的显著性

图5 各因素对酶解火龙果果汁甜菜红素保留率Y1、出汁率Y2和透光率Y3的影响作用显著性Fig.5 Pareto chart of effects of various factors on the (a): Y1,retention rate of betacyanin; (b): Y2, juice yield; and (c): Y3,juice transmittance

对酶解工艺各因素的二次项、一次项及其交互项对火龙果甜菜红素保留率、出汁率和透光率的影响作用显著性统计分析，结果如图5所示。

由图5a可知，对于酶解火龙果果汁的甜菜红素的保留率Y1，酶解温度和底物pH一次项有极显著的影响（p＜0.01），酶解温度二次项影响也显著（p＜0.05）。其他因素及之间的交互作用对果汁中甜菜红素保留率影响不显著。酶解温度是重要参数，从图3结果可知，50 ℃时出汁率最高，但对甜菜红素的保留不利，故应考虑以甜菜红素的保留为重要目标，兼顾出汁率和透光率目标，采用多目标同时优化工艺，更符合实际生产情况。

由图5b可知，对于酶解火龙果出汁率Y2，酶解温度、底物pH和酶添加量的二次项均有极显著的影响（p＜0.01）。酶添加量、酶解温度、底物pH一次项和酶添加量与温度、底物pH的交互作用也会显著影响果汁出汁率（p＜0.05）。

由图5c可知，对于酶解火龙果果汁的透光率Y3，底物pH和酶添加量二次项有极显著影响（p＜0.01），底物pH和酶解温度一次项有显著影响（p＜0.05）。

2.4 酶解工艺条件期望函数多目标优化

根据表2的试验结果，选取各响应值最大值为指标目标，并且考虑甜菜红素保留率指标为最重要，出汁率为其次，选取的优化参数见表 4。运行统计软件期望函数途径优化多目标程序，求出获得总体期望值最大时的X1、X2、X3的优化组合，结果见表5。

表4 优化参数Table 4 The parameters used for optimization

表5 优化的酶解工艺条件编码水平值及预测值Table 5 The coded variable levels and predicted responses under optimum conditions

由表5可看出，酶解工艺参数优化条件为：酶添加量X1在-0.17水平（实际取值285 U/g）；酶解温度X2在-0.36水平（实际取值46 ℃）；底物pH在0.42水平(实际取值pH 3.7)，酶解时间2 h，火龙果汁甜菜红素保留率、出汁率和透光率同时达到最大，预测值分别为80.3%，63.9%和88.4%。通过验证试验，在此条件下火龙果的甜菜红素保留率为 80.8±1.8%，出汁率为64.4±2.3%，透光率为89.5±0.8%，均与预测值相符。研究结果可为实际生产提供参考。

3 结论

3.1 在探讨了酶添加量、酶解时间、酶解温度和底物pH等单因素对火龙果果汁甜菜红素稳定性、出汁率和透光率的影响的基础上，采用Box-Behnken试验设计和响应面法分析，运行统计软件期望函数途径优化多目标程序，获得酶法制备火龙果汁的甜菜红素稳定性、出汁率和透光率多目标优化的工艺参数。

3.2 当果胶酶添加量为285 U/g，酶解温度46 ℃，底物pH为3.7，酶解时间2 h时，火龙果中的甜菜红素保留率可达到80.8%，出汁率可达到64.4%，透光率可达到89.5%。通过对所得模型的方差分析和响应面分析表明，试验所建立的模型回归性显著，试验拟合较好。该工艺较好地保留了红心火龙果汁原有的色泽，同时获得高的出汁率和透光率，对实际生产具有指导意义。

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