病毒性出血性败血症病毒RNA标准物质的研制

刘志玲,陈 茹,朱道中,吴晓薇,林志雄,田纯见,罗 琼,段燕喻

(广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室,广东 广州 510623)

病毒性出血性败血症(Viral haemorrhagic septicaemia,VHS)是感染鳟鱼及其他鲑科鱼类、大菱鲆等多种海水鱼类引起一种严重的致死性传染性疾病。其病原是弹状病毒科粒外弹状病毒属的病毒性出血性败血病毒(VHSV)[1]。该病主要病理变化为组织器官出血、变性、坏死。肝、肾是靶器官,细胞出现空泡化或固缩化[2]。死亡率可达到90% ～100%,对世界水产养殖业的发展造成巨大经济损失。该病最早发现于欧洲大陆及北美洲[3]。

VHS是世界动物卫生组织(OIE)[4]、亚太水产养殖中心(NACA)规定的必须通报的疫病,同时也是我国规定的进境必检疫病。国际组织通常对VHS感染国家水产品贸易采取一些限制措施,从而避免带病鱼类流动到其他国家和地区。VHS主要流行于北美洲和欧洲一些国家。迄今为止我国关于VHS暴发的报道极少,但随着我国水产养殖业的迅速发展和同国际上水产贸易的急剧增加,该病对我国鱼类养殖业形成很大的威胁[5]。

目前国内外对VHSV的检测方法大致可分为两大类:分子生物学方法和免疫学方法。其中分子生物学方法主要包括 RT-PCR[6]、实时荧光定量PCR[7]、逆转录环介导等温扩增法[8]、焦磷酸测序技术[9]、液相芯片检测技术等[10];免疫学方法主要包括中和试验[11]、免疫荧光[12]、酶联免疫吸附[13-14]等。

分子生物学检测方法耗时短、特异性强、灵敏度高、已广泛应用于动物疫病检测。《OIE水生动物疾病诊断手册》也推荐RT-PCR及荧光RT-PCR等方法检测VHS。但是由于VHS在国内发现较少,且活病毒的流通存在生物安全风险,阳性物质的缺乏制约了实验室检测技术的推广,因此急需构建安全、可靠的阳性核酸物质。

本研究根据《OIE水生动物疾病诊断手册》推荐的VHS分子生物学检测方法,利用基因克隆和体外转录技术制备了VHSV核酸检测标准物质,并从均一性、稳定性和定值等几个方面进行了评价。研制的阳性核酸物质不仅可以为VHS检测提供阳性质控,同时也可以用于不同试剂、设备以及不同实验室间的结果验证和比对,消除检测间的差异,使其结果具有溯源性。

1　材料与方法

1.1菌毒株及载体 VHS病毒为深圳出入境检验检疫局动植食检测中心水生实验室赠送;pGEM-T Easy Vertor System II载体,Promega公司产品;JM109大肠杆菌化学感受态细胞,北京天根生物技术有限公司产品。

1.2主要试剂 RNA提取试剂盒,Promega公司产品;一步法RT-PCR试剂盒、限制性内切酶NdeI,TaKaRa公司产品;DNA胶回收试剂盒,Axygen公司产品;质粒提取试剂盒、RNA纯化试剂盒,北京天根生物技术有限公司产品;体外转录试剂盒(Ribo-MAXTM Large Scale RNA Production System-T7),Progema公司产品。

1.3标准物质制备用毒株的鉴定 VHSV灭活病毒悬液由深圳出入境检验检疫局国家水生动物疫病检测重点实验室赠送。采用OIE水生动物疫病检测手册(第2.3.9章)推荐的常规RT-PCR方法鉴定,将扩增产物进行序列测定后与GenBank登录的序列进行同源性比对,确认毒株为VHSV。将该毒株用作VHSV核酸检测标准物质的研制。

1.4标准物质的制备

1.4.1重组质粒的构建 根据 GenBank登录的VHSV毒株的序列以及《OIE水生动物疾病诊断手册》推荐的VHSV检测方法,设计用于克隆VHSV NN基因的特异性扩增引物,引物序列见表1,并由ThermoFisher公司合成。对病毒核酸进行RT-PCR扩增后,对扩增产物进行测序分析。将序列正确的基因片段连接于pGEM-Teasy载体,转化JM109大肠杆菌感受态细胞,挑取白色菌落,经RT-PCR鉴定及序列测定鉴定为阳性后,用天根生化科技(北京)有限公司的高浓度质粒提取试剂盒进行质粒提取。该重组质粒命名为pGEM-N。

表1　引物和预期片段大小

1.4.2目标基因的体外转录 选择重组质粒中位于NNV RNA2基因下游的Nde I限制性内切酶位点对pGEM-N进行单酶切。以线性化的质粒为模板进行体外转录,体外转录体系如下:T7 Transcription 5 × Buffer,20 μL;dNTPs(25 mmol/L),30 μL;线性化质粒,5-10 μg;Enzyme Mix(T7),10 μL;去离子水,40 μL;总体积为100 μL。 反应条件为37℃温浴5 h。然后向反应体系中加入10 μL DNA酶,37℃温浴15 min除去DNA模板。最后用天根生化科技(北京)有限公司生产的RNA纯化试剂盒提取纯化。将RNA沉淀溶于RNase-Free H20中,得到制备好的N-cRNA片段。

1.4.3N-cRNA纯度及含量测定 将上述制备好的N-cRNA作100倍稀释后用NanoDrop 1000紫外分光仪测定其在波长260 nm与280 nm处的OD值,以分析其纯度和浓度。OD260/OD280值在1.8～2.0则RNA的纯度较高,比值低于1.8,说明RNA样品有杂质污染。同时根据单链RNA的相对分子质量(MW),按下式计算N-cRNA的拷贝数浓度。拷贝数(copies/μL)=(6.02 ×1023拷贝数/摩尔) ×(浓度g/μL)/(分子量 g/mol)。

1.4.4N-cRNA的稀释与分装保存 制备的N-cRNA用系列稀释成108～104copies/μL,采用荧光RT-PCR方法测定各浓度Ct值,从而获得标准曲线,建立回归方程。108copies/μL浓度的样品混匀后分装入冻存管,每管1.0 mL,分装300管,分别保存于室温(20℃ ～25℃)、冰箱冷藏(2℃ ～8℃)、-20℃,每个温度下保存20支,剩余的保存于-80℃。

1.5标准样品的检测分析

1.5.1均匀性试验 随机从-80℃保存的标准物质抽取10支样品,编号后用《OIE水生动物疫病检疫手册》2.3.9章中VHS荧光RT-PCR方法检测,进行Ct值标定,计算批间不精密度,该检测为一次操作,一次上机完成。批内不精密度的分析方法是将10支样品分别抽取10 μL进行混合,混合后分别用荧光定量RT-PCR方法检测10次。

1.5.2稳定性试验 从已分装好的标准物质中随机抽取样品按以下保存条件保存,每种条件保存4支。保存条件:(1)室温(20℃ ～25℃),相对湿度20% ～25%,7 d;(2)冰箱冷藏(2℃ ～8℃),1个月;(3)-20℃,6个月;(4)-80℃(不同条件下稳定性对照组)。取不同条件下的标准物质,分别用OIE推荐的VHS荧光RT-PCR方法检测,进行Ct值标定,观察标准物质的稳定性。

1.5.3定值检测与协作标定 采用荧光RT-PCR检测方法,并联合7家其他权威实验室对制备好的标准物质进行定值。定值方法为将标准物质候选物和已知量值的病毒核酸样品在相同的实验条件下分别进行荧光定量RT-PCR,在对候选物定性检测的基础上,用已知量值病毒核酸样品测定的Ct值(循环阈值)对所含模板拷贝数的对数值做线性回归,绘制标准曲线,得到标准回归方程,以此方程计算获得候选物的核酸量值,单位为copies/μL。

1.5.4不确定度分析 通过对实际检测过程进行分析,综合考虑人员操作者、设备和试剂带来的误差,确定标准品的总不确定度。应用不确定度的A类评定方法进行评定。

2　结果

2.1标准物质制备用毒株的鉴定和筛选 备用毒株经OIE推荐的常规RT-PCR检测方法鉴定为阳性,且反应结果特异、敏感,符合核酸标准物质制备用毒株的要求。序列分析表明,所扩增的片段与GenBank登录的其他VHSV毒株同源性均达90%以上,表明克隆所得到的 N基因可以有效代表VHSV的核苷酸序列,可用作核酸检测标准物质的研制。

2.2N基因片段的扩增 提取VHS病毒RNA,利用所合成的引物扩增N基因序列,RT-PCR扩增产物经电泳后观察结果(图1),扩增所得片段与预期大小相符。

2.3N-cRNA纯度及含量测定 将体外转录合成的cRNA测定其260 nm与280 nm的吸光度值(OD值),N-cRNA,OD260/OD280值 =1.97。 表明转录产物的cRNA纯度较高。依据所转录的单链RNA样品的分子质量和浓度计算获得cRNA样品的拷贝数。结果见表2。

图1　VHSV N基因的PCR扩增

表2　N-cRNA纯度及含量测定

2.4N-cRNA标准曲线的建立 取稀释成8.41×108～8.41×104copies/μL各浓度梯度的标准物质,每个浓度设两个重复,进行实时荧光定量RT-PCR测定Ct值。根据质粒拷贝数与Ct值的相关性,由SDS软件 2.1得标准曲线为 Y=-3.773X+49.981。 相关度 R2=0.994(见图 2)。

图2　不同稀释度标准物质的标准曲线

2.5标准物质的均匀性试验 对随机抽取的10支标准样品与混合后的10支标样进行实时荧光定量RT-PCR反应(图3),并将检测结果进行方差分析(F检验法),计算管间变异系数和批内均匀性,根据自由度及给定的显著性水平α,查表得临界的Fα值,再与公式算得的F值进行比较。结果显示,F＜Fα,表明分装的标准物质其组内与组间无明显结果差异,具有良好的均匀性。结果见表3。

图3　N-cRNA核酸标准物质均匀性试验结果

2.6标准物质的稳定性试验 取不同保存条件下的N-cRNA,并将检测组与对照组(-80℃)进行Ct测定,数据分别作t检验,结果各检测组t值均小于t检验的临界值(表4),表明各检测组在稳定性监测期内是稳定的。

2.7标准物质的定值检测与协作标定 本次定值联合8家单位参加协作标定,采用测定标准物质浓度,根据片段长度换算拷贝数和协作标定的方式,计算标准物质含量(copies/μL)。8家单位采用统一的试验方案和结果分析程序,分别取得3次独立的有效结果,其结果与研制单位的标定结果经统计学分析获得平均值,结果见表5。

2.8标准物质的不确定度分析 通过对实际检测过程进行分析,确定标准品的总不确定度,包括:分析测定误差、RNA提取过程的误差和样本不均匀性引起的误差。定值方法应用A类评定方法进行评定,经计算N-cRNA标准物质的不确定度为0.149×108copies/μL,定值为(6.625 ±0.149) ×108copies/μL,结果见表5。

表3　VHSV核酸标准样品(N-cRNA)均匀性试验结果

表4　VHSV核酸标准物质不同保存条件下稳定性试验结果

3　讨论

在动物病毒检测方法中,分子生物学检测方法因特异性强、敏感性好是目前最为常用的方法之一。阳性质控用于验证PCR反应的可靠性,对PCR试验的质量控制有至关重要的作用。核酸标准物质属于生物标准物质的一种,可作为核酸扩增技术的阳性质控品,在促进病原核酸扩增检测方法标准化及提高检测一致性和准确性方面发挥了重要作用。与重组质粒相比,本研究利用体外转录制备的RNA标准物质可在扩增检测的逆转录和PCR扩增两个方面进行质量控制,更符合RNA病毒检测标准物质的要求[15]。

表5　VHSV核酸标准物质定值结果

由于VHS目前在我国内报道极少,大部分实验室由于缺乏病毒阳性质控制约了检测能力的建立。本研究构建基于VHSV N基因的RNA标准物质无生物安全风险,不易对实验仪器和环境造成交叉污染而导致假阳性结果,在实际检测中具有很好的适用性。该标准物质可用于实验室检测的质控标准,也可用于不同实验室间、不同人员、不同试剂的比对标准。该标准物质在我国各检验检疫实验室及各地方水产技术推广站的推广应用,将可推进我国VHSV检测尽早达到标准化,提升疫病防控把关能力。