炎症刺激对新生仔猪铁含量 血清生化指标及Hepcidin基因表达量的影响

李梦云,梁晓晓,段新安,聂芙蓉,哈斯通拉嘎,李婉涛

(1.河南牧业经济学院饲料工程中心,河南 郑州 450011;2.河南广安生物科技股份有限公司,河南 郑州 450001;3.河北省曲周县畜牧局,河北 曲周 057250)

铁调素(Hepcidin)是一种由肝脏分泌的含半胱氨酸的阳离子抗菌肽[1],可通过抑制小肠铁吸收、单核巨噬细胞系统铁释放来调节铁吸收,从而维持机体铁平衡[2],因而可通过调控Hepcidin基因表达量来调控机体铁吸收。小鼠和大鼠上的研究表明,饲粮铁过量和炎症可诱导Hepcidin的生成[3],贫血和缺氧则抑制其表达量[4]。但在猪体内特别是在新生仔猪体内关于Hepcidin mRNA表达量调控的研究较少,因此有必要进行这方面的研究。脂多糖(LPS)是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分,能释放出内毒素,常用于构建动物炎症刺激模型。本试验拟通过对新生仔猪注射LPS,并通过实时荧光定量PCR方法,探讨炎症刺激对仔猪Hepcidin mRNA表达量的影响,为研究炎症刺激、机体铁含量及Hepcidin mRNA表达量之间的关系提供理论基础。

1　材料与方法

1.1试验设计与试验动物 挑选刚出生健壮的平均体重为(1.36±0.18)kg杜长大三元杂交仔猪10头,随机分为2组,即对照组和脂多糖刺激组,每组5个重复,每个重复1头猪。炎症刺激组分别于3日龄、5日龄和7日龄时腹腔注射LPS(Sigma公司)1 mL/kg(含 LPS 100 μg/kg·bw),建立炎症应激模型。对照组仔猪分别在相同日龄注射相同体积生理盐水。7日龄时,将所有仔猪全部处死,采集血清,并分离肝脏和脾脏,测定血液生化指标、机体铁含量和肝脏中抗菌肽基因Hepcidin mRNA表达量。

1.2样品采集与处理

1.2.1血清取样 7日龄时,屠宰后采血10 mL,3 000 r/min离心15 min,取上清液-20℃保存,用于血液指标及血清铁含量的测定。

1.2.2肝脏、脾脏取样 屠宰仔猪后快速取仔猪右侧肝脏2 g左右,剪碎后装入无RNA酶1.5 mL EP管中,迅速在液氮中冷冻,-70℃保存,用于提取总RNA。并尽快采集肝脏、脾脏样品10 g,-20℃保存,用于测肝脏、脾脏中铁含量。

1.3测定指标与方法

1.3.1肝脏、脾脏和血清中铁含量的测定 准确称取0.2 g肝脏、脾脏样品,采用Z-2000系列原子吸收分光光度计测定肝脏、脾脏和血清中铁含量。

1.3.2血清生化指标的测定 所有血清指标均送往郑州市第五人民医院检验科测定。

1.3.3肝脏中Hepcidin mRNA表达量的测定 每个重复取30 mg肝脏样品在液氮并研磨成粉,收集于1.5 mL Eppendorf管中,用RNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司,SK1312)提取总RNA,具体过程按试剂盒操作说明书进行。将提取的总RNA作为模板,用cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司,SK2445)进行RT反应。 反应体系:总 RNA 5 μL、Oligo dT 引物1 μL、RNA 酶抑制剂 1.0 μL、dNTP Mixture 2 μL、5 × RT缓冲液 4 μL、反转录酶 2 μL、无 RNA 酶去离子水5 μL。 按70 ℃ 5 min、冰浴10 s、37 ℃ 5 min、42 ℃60 min、70℃ 10 min程序在 Mastercycler Gradient PCR仪中进行RT反应。

Hepcidin基因(AF516143)和内参基因β-actin(AY550069)引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,各基因引物序列如下:Hepcidin-F:5′-TCCGTTCTCCCATCCCAGAC-3′、Hepcidin-R:5′-GCAGCACATCCCACAGATTG-3′;β-actin-F:5′-TGCGGGACATCAAGGAGAAG-3′、β-actin-R:5′-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGG-3′。定量 PCR反应体系总体积为20 μL,反应体系如下:cDNA 2 μL、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、上、下游引物(10 μlmol/L)各 1μL、0.1%DEPC 处理水 6 μL。 定量PCR反应程序如下:95℃ 3 min,95℃ 30 s共40个循环,最后70℃延伸5 min。分别测目的基因Hepcidin 和内参 β -actionCt值,用 2-(ΔΔCt)表示 Hepcidin基因相对表达量。

1.4统计分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析,并进行t检验,试验结果用平均值±标准误表示。

（4）作业环节的数字化。如对测斜井深、短起下井深、短起下井段等施工环节进行数字化规范，以数字化的作业环节保证井身质量、施工质量。

2　结果与分析

2.1LPS刺激对新生仔猪肝脏、脾脏和血清中铁含量的影响 由表1可知,与对照组相比,LPS刺激组仔猪肝脏铁含量显著降低(P＜0.05),血清中铁含量极显著降低(P＜0.01),脾脏铁含量也降低,但差异不显著(P＞0.05)。

表1　LPS刺激对新生仔猪肝脏、脾脏和血清中铁含量的影响

表2　LPS刺激刺激对新生仔猪血清生化指标的影响

2.3LPS刺激对新生仔猪肝脏中Hepcidin mRNA表达量的影响 由表3可知,LPS刺激显著提高了仔猪肝脏中Hepcidin mRNA表达量(P＜0.05),比对照组提高了43.32%。

表3　LPS刺激对新生仔猪肝脏中Hepcidin mRNA表达量的影响

3　讨论

3.1LPS刺激对新生仔猪血清生化指标的影响 LPS是一种革兰阴性菌膜结构物质,导致肠源性内毒素血症和细菌移位,大量细菌和毒素机体体内,引起动物应激反应[5]。谷丙转氨酶在动物体内分布广泛,且在血液中含量较低,主要反映肝脏的结构和功能。本试验LPS刺激对血清中谷草转氨酶无显著影响,表明炎症刺激并未破坏仔猪肝脏正常功能。血清TP分为ALB和GLB,是反映动物机体营养水平、蛋白质的吸收和代谢状况,以及机体免疫水平的重要指标,通常也是动物发生应激反应的标志[6]。本试验中LPS刺激降低了仔猪血清TP和GLB含量,与刘玉兰等(2008)[7]的结果一致。表明仔猪受到了较强的应激,仔猪的免疫功能降低。

本试验结果还表明,LPS多次刺激可显著降低血清总胆红素含量。血清中的胆红素由衰老的红细胞被破坏后产生出来的血红蛋白衍化而成,总胆红素偏低的有可能是因为贫血。本试验结果也表明,炎症刺激可显著降低肝脏铁和血清铁含量,因而可以理解成LPS多次刺激仔猪炎症发生,进而导致贫血,因而降低了总胆红素含量,但这方面还有待于进一步的研究。血糖主要是指血液中的葡萄糖,来源为肠道吸收、肝糖原分解或肝内糖异生生成的葡萄糖释放入血液中,本试验表明,LPS刺激显著降低了仔猪血糖含量,三羧酸循环是动物体内糖有氧氧化、供能的一个重要途径。血糖含量降低表明炎症刺激影响了仔猪正常生理功能,该结果与李爽等(2012)[8]研究结果一致。

3.2炎症刺激对新生仔猪机体铁含量及肝脏中Hepcidin基因表达量的影响 关于炎症刺激对仔猪肝脏Hepcidin基因表达量的影响还未见报道。在大鼠[9]和人[10]上的研究均表明,炎症或感染性疾病均可使肝脏和肠道Hepcidin基因表达量增加。本试验结果表明,PLS诱导的炎症刺激可提高新生仔猪肝脏中Hepcidin基因表达量,从而抑制铁吸收,降低机体铁含量。Oliveira-Filho等(2012)[11]在马上的研究表明,Hepcidin和细胞因子IL-6 mRNA水平在注射脂多糖6 h后升高。Besson-Fournier等(2012)[12]研究表明,炎症诱导的hepcidin激活主要是通过 Smad1/5/8途径,随后 Shanmugam等(2014)[13]利用IL-10基因敲掉的小鼠采用硫酸葡聚糖钠构成结肠炎模型,进一步证实炎症调控Hepcidin主要依赖于红细胞生成素的活性以及肠道菌群。关于调控Hepcidin基因表达的上游信号途径还有待于进一步研究。另外,在炎症状态下,Hepcidin基因表达量增加,促使铁转运蛋白(Ferroportin)进入细胞后降解,铁的转出被阻断,铁就被锁在巨噬细胞中,导致小肠铁的吸收以及血清铁浓度降低。因而炎症往往也伴随着贫血[14]。