STIL在肝细胞癌中高表达及其预后价值

袁勇刚，李文娟，周杭城，彭　燕，王　伟，胡　冰

肝细胞癌，简称肝癌，是常见的消化道恶性肿瘤之一，具有易侵袭转移等特点，患者预后极差[1-2]。目前有关肝癌诊疗及找寻预测预后的有效生物学指标是该领域的研究热点。STIL(SCL/TAL1 interrupting locus，STIL)基因是从人类急性T淋巴细胞白血病相关染色体重排中克隆而来，其进化高度保守，主要与中心体形成及数目调控、纺锤体形成和染色体分离密切相关[3-4]。研究[5-6]表明，STIL还可作为一种癌基因在肺癌、胰腺癌等组织中表达增高，且其高表达与肿瘤侵袭及预后有关，但在肝癌中的表达及预后意义尚未见详细报道。该研究采用生物信息学预测结合免疫组化验证的方法探讨STIL在肝癌中的表达水平及其预后价值。

1　材料与方法

1.1生物信息学预测选择癌症公共数据库Oncomine和TCGA进行生物信息学预测。在Oncomine数据库中输入基因名“STIL”和差异基因分析模块输入“Hepatocellular carcinomavsnormal”检索分析结果；下载TCGA数据库中的肝癌数据，共有364例肝癌患者具有STIL基因表达的信息，按其表达水平高低降序排列，排名前50%计为STIL高表达(182例)，排名后50%计为STIL低表达(182例)，而后与患者的总生存期(overall survival，OS)关联，运用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。

1.2肝癌患者标本及其临床病理资料回顾性收集2010年6月～2016年9月在安徽医科大学附属省立医院行肝切除术的肝癌患者(共计67例)的癌与癌旁配对的石蜡组织标本，术后病理均证实肝癌，随访时间截止到2017年9月。患者相关的临床信息包括：性别、年龄、肿瘤大小、有无肝硬化、有无脉管侵犯、TNM分期等。本研究已经安徽医科大学附属省立医院伦理委员会审批，所有患者已签署知情同意书。

1.3免疫组化染色及结果判读采用免疫组织化学染色SP法对上述标本进行检测，具体操作方法按照试剂说明书进行。一抗为STIL兔多克隆抗体(货号：ab222838)，购自英国Abcam公司，工作浓度为1 ∶500。染色结果判读：结果采用盲法测定，每张切片均由两名病理科医师进行独立判断，参照之前的判读方法[7]，根据染色强度(staining intensity，SI)乘以染色阳性细胞数(percentage of positive cells，PP)的百分比计算免疫反应性评分(IRS)，详细评分标准如下：SI(0～3分)：0为阴性，1例为弱阳性，2例为中度阳性，3例为强阳性；PP(0～4分)：0为阴性，1为1%～25%，2为26%～50%，3为51%～75%，4为76%～100%。IRS评分范围为0～12分，若IRS> 4分，则计为STIL高表达；若IRS≤4分，则定义为STIL低表达。

1.4统计学处理采用SPSS 19.0软件进行分析。公共数据库Oncomine和TCGA下载的肝癌与正常组织数据之间的对比采用两独立样本t检验。率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，Kaplan-Meier法(log-rank test)进行单因素生存分析，而后将在单因素生存分析有意义的因素代入进行Cox多因素生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肝癌及癌旁组织中STIL的表达水平Oncomine数据库共检索到4项有关“肝细胞癌vs正常肝组织”的研究涉及到有STIL基因mRNA表达水平的信息(图1)，结果均显示：与正常肝组织相比，STIL基因mRNA在肝癌中呈现显著高表达，差异有统计学意义。随后，为验证上述预测结果，采用免疫组化法对67例肝癌和癌旁配对组织进行检测，结果显示：STIL蛋白主要表达于肝癌细胞质中(图2A)，其在肝癌中高表达阳性率为65.7%，而在配对癌旁正常组织中多为低表达(图2B)，高表达阳性率仅为37.3%，两组的表达率差异有统计学意义(χ2=10.786，P=0.001)，见表1。这一蛋白表达结果与Oncomine数据库预测的mRNA表达结果相一致。

图1　Oncomine数据库预测STIL基因在肝癌中高表达

A: Roessler Liver(GEO：GSE14520)；B：Mas Liver(GEO：GSE14323)；C：Roessler Liver 2(GEO：GSE14520)；D：Wurmbach Liver(GEO：GSE6764)

图2　STIL基因在肝癌及癌旁正常组织中的蛋白表达水平(bar=50 μm)

2.2肝癌中STIL的差异表达与患者临床病理参数的关系随后，对肝癌中STIL差异表达水平与患者的各项临床病理参数的关系进行检测显示(表2)：STIL的不同表达水平(高表达vs低表达)与患者的年龄(≤60岁vs> 60岁)、性别(男性vs女性)、Edmondson分级(Ⅰ～Ⅱ级vsⅢ～Ⅳ级)、肿瘤大小(≤ 5 cmvs>5 cm)、脉管侵犯(有vs无)及肝硬化(有vs无)指标差异均有统计学意义，而仅与TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期vsⅢ～Ⅳ期)有关(P=0.006)。

4.创新活动载体。要提高党组织的凝聚力和战斗力，创新活动载体、保证活动成效十分关键。结合社会组织主要分布在油田各行各业、在职党员具有较强的业务知识等特点，引导社会组织“适时、适宜、适度”地参与油田各项建设，引导他们参与油田的各项便民利民服务，如定期不定期举办法律、医疗保健，家庭理财等方面的咨询服务等，并通过建立服务志愿者队伍，把参与结果作为吸收入党、评选先进的一项重要参考指标，吸引更多的新社会组织从业人员投入到油田发展，使越来越多的员工群众从中受益。

表1　STIL在肝癌及配对癌旁组织中的蛋白表达水平[n(%)]

表2　STIL差异表达水平与肝癌患者各临床病理参数的关系(n)

a表示采用Fisher精确概率法，其余应用χ2检验

2.3肝癌中STIL的表达预测患者预后的价值对STIL基因差异表达水平与肝癌患者预后的关系进行探索。TCGA数据库预测的结果显示：STIL基因mRNA水平高表达的肝癌患者预后显著差于其低表达患者(图3A，P=0.003)。为验证这一结果，随后对免疫组化检测的结果进行统计分析显示：与之相似，STIL基因蛋白高表达的肝癌患者的生存时间显著低于其低表达者，差异有统计学意义(图3B，P<0.001)；Kaplan-Meier单因素生存分析显示：STIL表达水平(高表达vs低表达)、脉管侵犯(有vs无)以及TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期vsⅢ-Ⅳ期)是影响肝癌患者生存时间差异的显著因素(表3)；而将这3个有意义的单因素代入Cox多因素生存分析中显示：STIL表达水平以及TNM分期可作为肝癌患者预后的独立预测因子(P<0.001，P=0.001)，见表4。

3　讨论

肝癌在我国属于较常见高发的恶性消化道肿瘤，具有富血管性、易复发转移等特点，其常见治疗手段包括肝切除术、肝移植、TACE介入治疗等，但对传统的化疗药物不敏感，患者一般预后较差。因此，进一步探索及开发有价值的生物标志物来预测疗效或成为靶向治疗的有效药物显得尤为必要和迫切。STIL基因属于中心粒复制相关因子，源于与人类急性淋巴细胞白血病相关染色体重排克隆，近期有研究[8-9]表明其可通过调节中心体结构与数目，影响染色体不稳定性形成，参与恶性肿瘤的发生和发展。但STIL基因在肝癌中的表达情况及其是否对肝癌患者的预后有预测价值尚不清楚。

表3　肝癌患者的Kaplan-Meier单因素生存分析

表4　肝癌患者的Cox多因素生存分析

因此在本实验中，首先运用生物信息学的方法，在Oncomine公共数据库预测到STIL基因在肝癌组织中的表达明显高于正常组织(P<0.05)；然后，采用免疫组化的方法对收集的67例肝癌及配对的癌旁组织进行检测显示：与正常肝组织相比，STIL蛋白在肝癌组织中显著高表达，差异有统计学意义(P<0.001)。这一真实数据结果与生物信息学预测结果相一致。事实上，STIL基因在已报道的多种恶性肿瘤中呈现高表达，如肺癌[4]、结肠癌[9]、胰腺癌[6]及胃癌[10]。这些结果也一定程度上提示：STIL基因在恶性肿瘤中可能扮演着促癌基因的角色参与着肿瘤发生发展等生物学进程。

图3　基于STIL差异表达水平应用Kaplan-Meier法绘制的总生存曲线

A：基于TCGA数据库预测的STIL基因mRNA水平与总生存期曲线；B：基于真实数据STIL基因蛋白水平与总生存曲线

随后，又对STIL基因表达水平与肝癌患者的临床预后意义进行了探索。首先相关性分析显示：STIL的差异表达与肝癌患者的TNM分期有关；随后运用Kaplan-Meier单因素生存分析(log-rank test法)显示：STIL高与低的差异表达水平、有无脉管侵犯以及TNM不同分期的肝癌患者其生存时间差异具有统计学意义；而将这3个有意义的单因素代入Cox多因素生存分析显示：STIL高表达以及TNM分期(Ⅲ-Ⅳ)是可作为预测肝癌患者预后不佳的独立预测因子。这一结果与利用TCGA公共数据库的数据预测结果相一致。而在其它恶性肿瘤中，研究者们也发现与之类似的现象：STIL基因高表达可以促进肿瘤细胞增殖、生长、侵袭转移。上述结果提示：STIL基因高表达预示着肝癌患者预后不佳，该基因可能是参与肝癌生长、转移等过程的关键靶点基因，但其详细机制尚不清楚。

综上，本研究结果证实STIL基因在肝癌中高表达，且高表达的STIL可以作为预测肝癌患者预后不佳的独立预测因子。未来STIL基因有望成为肝癌患者治疗的新靶点。

参考文献