某医院黏质沙雷菌碳青霉烯耐药机制及流行病学研究

饶碧华，储新民

黏质沙雷菌是肠杆菌科中重要的条件致病菌之一，常贮存于成人泌尿道、呼吸道以及儿童的胃肠道等部位，当机体免疫功能降低可引起泌尿系统感染、肺炎、败血症等。根据2014～2016年CHINET中国细菌耐药性检测报告，提示近年来黏质沙雷菌分离率和耐药率日益上升，2016年沙雷菌属占所有标本分离菌株的1.16%，居革兰阴性杆革菌的第9位，已经成为临床上医院感染重要病原菌属。黏质沙雷菌是沙雷菌属中临床最常见的一种，定期监测其临床分布和耐药性变化对预防和控制医院感染极为重要。碳青霉烯类抗生素对几乎所有由质粒或染色体介导的β内酰胺酶稳定，且具有良好的通透性，是目前抗菌谱最广的抗菌药物，具有快速杀菌的作用，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南、帕尼培南等[1]，是治疗细菌感染的终极武器。但是，近年来随着碳青霉烯类药物在临床上广泛使用，对碳青霉烯类药物耐药的黏质沙雷菌比例日益增高，给患者的感染控制带来了严峻考验。该实验主要研究黏质沙雷菌碳青霉烯耐药机制，同时对耐药菌的同源性进行探究，为院内爆发性感染进行预防控制奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌株的来源收集院内2017年3～7月临床分离物中无重复患者的黏质沙雷菌株25株，其中非敏感菌株17株(14株耐药、3株中介)作为实验标本。质控菌株为大肠杆菌标准菌株ATCC25922、ATCC8739和肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706。

1.2仪器与试剂主要仪器包括VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统(法国梅里埃生物公司)；MALDI-TOF-MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(北京毅新博创生物科技公司)；Biometra PCR扩增仪(德国Biometra公司)；POWERPAC BASIC电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Bio-Top凝胶成像仪(上海山富科学仪器有限公司)；Sigma 1-14小型台式离心机(德国西格玛公司)。主要试剂包括 GN鉴定卡和GN13药敏卡(法国梅里埃生物公司)；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒和即用PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程公司)；药敏纸片(英国OXOID公司)。

1.3引物引物SME-1、VIM-2、IMP-1、OXA-23、OXA-48、NDM-1、KPC-2、TEM、SHV、GES、CTX-M-1、CTX-M-2，CTX-M-9由clone manager设计，CTX-M-9、ERIC参考文献[2-3]，由安徽通用生物公司合成，见表1。

1.4碳青霉烯耐药表型筛选参照CLSI指南应用改良Hodge试验(modified Hodge test, MHT)检测，被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强，即为改良Hodge试验阳性，提示待测菌株产生碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706分别为阳性和阴性的质控菌株。

1.5细菌鉴定与药敏应用VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统进行细菌鉴定，运用飞行时间质谱仪来进行复核细菌鉴定结果，以保证实验菌株的准确性。另外，运用VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统检测MIC，根据 CLSI M100 S25 标准对结果进行判读。

1.6耐药基因的检测与分析提取基因组DNA作为模板，设置PCR反应体系为50 μl，其包括sterilized ddH2O222 μl、2 × HiFi-PCR Master 25 μl、DNA模板1 μl、上下游引物各1 μl(浓度为20 μmol/L )。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸7 min。配制1%的琼脂糖凝胶对产物进行电泳45 min，结束后凝胶成像仪内紫外灯观察结果。

1.7同源性分析利用ERIC-PCR对17株耐药黏质沙雷菌进行同源性分析，反应体系如1.6所述，PCR扩增条件为95 ℃预变性7 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，65 ℃延伸6 min，30个循环，65 ℃延伸12 min。配制1.2%的琼脂糖凝胶在100 V电压下对产物进行电泳70 min，结束后置凝胶成像仪观察结果。

2　结果

2.1标本来源基本情况分析患者年龄1～100(64±28)岁，其中男14例(82.4%)，女3例(17.6%)。以深部痰标本为主(15株，89.5%)，仅2株为引流液标本(10.5%)。科室分布主要为重症医学科(10株，58.8%)，其次为干部病房(5株，29.4%)和脑外科(2株，11.8%)。

2.2改良Hodge试验的结果17株细菌中MHT阳性14株(82.4%)。其中部分阳性结果示意图见图1，其中1705、1706分别为MHT的阳性及阴性质控菌株。

2.3药敏结果分析17株非敏感菌对氨曲南、环丙沙星、头孢曲松、厄他培南、亚胺培南、庆大霉素高度耐药，呈现明显的多重耐药的特征，对阿米卡星和复方新诺明敏感。8株敏感菌仅对头孢曲松表现出高度耐药和妥布霉素中介，其余药物敏感性较高。见表2。

2.4耐药基因特异性引物PCR扩增结果PCR扩增后进行测序，最后确认检测出10株细菌含有CTX-M-14，5株含有KPC-2，2株含有TEM，1株含有NDM-1，1株含有SHV基因，并出现了6株细菌同时含有多种耐药基因的情况，同时也有5株细菌未检出任何耐药基因。耐药基因SME-1、VIM-2、IMP-1、OXA-23、OXA-48、GES、CTX-M-1、CTX-M-2均未检出阳性结果，见图2、3。

表2　17株耐碳青霉烯类和8株敏感黏质沙雷菌药敏结果(n)

R(resistance,耐药);S(sensitive,敏感);I(intermediate,中介)

图1　部分黏质沙雷菌MHT结果

图2　17株细菌KPC-2阳性结果示意图

M：DL Marker 2 000；N：阴性对照；3、4、12、15、17：阳性标本，分子大小为734 bp;其余为阴性标本

2.5同源性分析结果判断依据条带完全相同者为同一基因型，相差一条为同一基因型中的不同亚型，相差两条以上为不同基因型[4]。实验结果判断17株细菌中有11株(1、3、5、6、7、10、11、13、14、15、17)为同一型别，2、4、8、9、12、16为各自型别，见图4。

图3　17株细菌NDM-1阳性结果示意图

M：DL Marker 2 000；N：阴性对照；16：阳性标本，分子大小为697 bp;其余为阴性标本

图4　17株细菌ERIC-PCR分型

3　讨论

黏质沙雷菌具有侵袭性并对多种常用的抗生素天然耐药，是引起肠道外感染的重要病原菌，可致肺炎、菌血症、泌尿系统、外科手术部位等感染。通过对收集菌株来源的分析，结果显示耐碳青霉烯黏质沙雷主要来自重症医学科和干部病房，患者平均年龄64岁，说明患者年龄大以及自身免疫情况差是黏质沙雷菌感染的重要因素，与黄中海 等[5]研究一致。其耐碳青霉烯抗生素问题已经引起了高度关注，2014、2015年CHINET全国耐药监测显示黏质沙雷对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为6.7%、7.0%和8.1%、8.3%，直至2016年的8.6%、8.3%，耐药率呈现出不断上升的趋势[6]。在本院收集的25株黏质沙雷菌中，14株对碳青霉烯类药物耐药，并有3株呈现出中介的情况，耐药的比例高达56%，远远高于全国平均水平。

分析2016年CHINET全国药敏数据显示沙雷菌属对厄他培南、头孢吡肟、头孢他啶、阿米卡星、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率均≤10%，而本次研究收集的25株黏质沙雷菌药敏结果仅阿米卡星与CHINET结果一致，厄他培南、头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦耐药率远高于全国平均数据。17株耐碳青霉烯类黏质沙雷菌与侯沪 等[7]文献中提到的165株耐碳青霉烯黏质沙雷菌药敏结果相比较，阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、庆大霉素、复方新诺明耐药率较为一致；头孢他啶、环丙沙星、左旋氧氟沙星、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦差异较大，除哌拉西林/他唑巴坦耐药率为0之外，其他耐药率均大幅度高于其药敏结果。说明本院黏质沙雷菌耐药情况严重，抗生素选择有限，推荐临床使用阿米卡星或复方新诺明治疗，其他药物根据药敏结果合理使用。

黏质沙雷菌耐药机制复杂，包括：① 产碳青霉烯酶；② 高产ESBL或高产 AmpC酶合并孔道蛋白缺失或下调，导致对碳青霉烯类抗生素的敏感性降低；③ 碳青霉烯类抗生素的作用靶点PBP蛋白改变。产碳青霉烯酶为耐碳青霉烯类黏质沙雷菌的主要机制[8]。在本次的研究中检测出了KPC-2、NDM-1碳青霉烯酶和TEM、SHV、CTX-M-14超广谱酶。KPC-2是我国目前肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类药物最常见的碳青霉烯酶[8-9]。依据Bush分类，KPC属于丝氨酸酶A中的2f分类。最初于2001年在美国北卡罗来纳州于肺炎克雷伯菌分离株中被描述，并且在全世界迅速出现并传播，特别是肠杆科细菌中。随后主要在美国、中国、以色列和几个欧洲国家被报道。Cuzon et al[10]发现大多数细菌含有KPC-2时并会同时具有其他获得性β-内酰胺酶基因，与本次实验结果较为符合。此次实验还发现了国内偶见报道的NDM-1基因，NDM-1阳性菌株的首次发现是在2008年瑞典，一位由于在印度新德里获得肺炎克雷伯菌感染而引起尿路感染的患者中[11]。NDM-1是一种超级耐药基因，能够编码新的耐药酶，全称为“新德里金属β-内酰胺酶1”。此酶具有高效性，能水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类药物[12]。产生NDM-1的多重耐药细菌引起的感染通常需要两种或三种抗生素联合治疗[11]。

在本研究中运用到的MHT易于操作，无需特殊的试剂或者培养基就可以检测碳青霉烯酶。17株细菌中14株结果为阳性，与PCR扩增结果相一致，同时也出现了MHT阳性但并未检测出耐药基因，可能原因为菌株产ESBL或AmpC合并外膜蛋白缺失[13]。这个需要下一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测外膜蛋白情况和RT-PCR半定量表达的AmpC。

ERIC-PCR揭示了17株细菌的同源性情况。由于每个细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，ERIC-PCR通过对两个相邻的ERIC保守序列之间区域的扩增，可以得到由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱。通过ERIC-PCR鉴定17株细菌中11株为同一个型别，其他6株为各自不同型别。这11株细菌的同型别提示应当注意耐碳青霉烯类黏质沙雷在医院内的播散。碳青霉烯酶可以通过诸如整合子或质粒的移动元件进行扩散，不断的监视将是防止传播的最佳措施之一[14]。加强无菌物品和各种管道及医疗设施、器械的消毒管理；加强手卫生的管理，提高医务人员手卫生的意识；严格实施无菌操作和消毒隔离措施，防止患者之间的交叉感染[15]；合理、谨慎地使用抗菌药物，以延缓和减少耐药菌的产生。总而言之，医院黏质沙雷菌检出率较高，耐药性增加，耐药机制复杂，应强调临床合理选择用药和持续监督及有效预防措施，以控制和减少耐碳青霉烯类黏质沙雷菌的传播。