miR-146a和miR-185对恶性胸腔积液的诊断价值

郑丹丹， 钱粉红， 邓霞， 庄琼馨， 柳星星

(江苏大学附属医院呼吸内科， 江苏 镇江 212001)

恶性胸腔积液是由肿瘤侵袭胸膜后导致人体胸膜腔内液体异常增多所致。患者出现恶性胸腔积液提示肿瘤已发生远处转移，属于肿瘤晚期，预后往往较差。因此，临床上对恶性胸腔积液的早期诊断尤为重要。胸腔积液穿刺检查不仅可缓解患者呼吸困难，还可进行胸腔积液的细胞病理学检查以及胸膜活检，而后两种病理学检查是诊断恶性胸腔积液的金标准，但阳性率偏低[1-2]。胸腔积液肿瘤标志物如癌胚抗原虽有较高的特异性，但诊断的敏感性往往欠佳[1]。因此，寻找一种无创、准确率高、操作方便、费用低、并发症少的鉴别胸腔积液良恶性的方法是目前临床上急需解决的难题。

现发现在多种疾病中，患者的痰液、关节液、脑脊液、血液等体液中存在一些种类miRNA的差异表达[3-7]，这些miRNA有可能成为诊断的特异性标志物。本研究拟选用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测恶性胸腔积液和良性胸腔积液中miR-146a、miR-185的相对表达量，并构建受试者工作特征曲线(ROC)，评价这两种miRNA用于鉴别诊断恶性胸腔积液的临床效能。

1 对象与方法

1.1 病例和标本

收集2016年2月到2017年12月在本院诊断为胸腔积液病例的胸腔积液标本共81份。标本的纳入标准：胸腔积液病因诊断明确，并且为初诊初治患者，均未经抗结核治疗、化疗、放疗、分子靶向、生物免疫治疗。标本中包括恶性胸腔积液40例，均经细胞组织病理学证实，其中肺腺癌34例，肺鳞癌2例，小细胞肺癌4例,年龄中位数为65.00岁；良性胸腔积液41例，其中结核性胸腔积液24例，类肺炎性胸腔积液12例，漏出性胸腔积液5例，年龄中位数为56.61岁。良、恶性胸腔积液患者的年龄、性别分布间差异无统计学意义(P>0.05，表1)。标本采集前均告知患者相关并发症风险并经患者知情同意。

表1 两组胸腔积液患者的年龄和性别分布 例

1.2 标本收集

常规B超定位胸腔积液后对患者行胸腔穿刺术，用含有枸橼酸钠抗凝剂的50 mL无菌离心管收集200 mL的胸腔积液，充分摇匀后，立即置于4 ℃，1 500 r/min离心20 min。离心后弃上清液，采用红细胞裂解液裂解胸腔积液沉淀物中的红细胞，吹打混匀后置于4 ℃的离心机中，500 r/min离心5 min。离心后去上清液，用PBS液冲洗沉积物2次，离心后在沉积物中加Trizol液，吹打混匀后置于-70 ℃的冰箱冻存。同时收集患者胸腔积液中癌胚抗原及CYFRA 21-1的检测值资料。

1.3 RT-PCR检测胸腔积液中miR-146a和miR-185的表达

1.3.1 RNA提取 采用Trizol法(广州锐博生物有限公司提供试剂)提取胸腔积液沉淀物的总RNA，使用U-2800 紫外分光光度仪测定其浓度及纯度，置超低温冰箱(-70 ℃) 储存备用。

1.3.2 反转录合成cDNA 使用日本TaKaRa公司提供的反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent(RR037A)，由广州锐博公司提供引物，并按照该公司提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的操作说明反转录合成cDNA。随后的操作均在冰上完成：取2μg的总RNA，分别加入2μL miR-185、miR-146a、U6的反转录引物工作液，加DEPC水至11μL，放置PCR机70 ℃10 min后冰上孵育2 min；随后加5×PrimeScript缓冲液7μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL,加DEPC水至25μL体系，放置于PCR机42 ℃60 min，70 ℃10 min一个循环后立即取出，冰上孵育2 min，最后置-20℃冰箱储存备用。

1.3.3 RT-PCR 使用日本TaKaRa公司提供的实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix EX TaqTM(RR420A)，由广州锐博提供引物，并按照锐博公司提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的说明书操作。随后实验操作均在冰上完成：取2 μL cDNA，加入9 μL SYBR、0.4 μL ROX，前引物和后引物各0.8 μL，最后加DEPC水至20 μL，置于荧光定量PCR仪Mx3000p 95 ℃ 20 s 1个循环；95 ℃10 s，60 ℃20 s 40个循环；95 ℃15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s 1个循环。计算机自动输出标本的扩增、熔解曲线、CT值。采用2-△Ct计算胸腔积液中miR-185、miR-146a的相对表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0软件分析实验数据。检测值均符合非正态分布，因此选用中位数表示计量资料。选用Mann-WhitneyU秩和检验对两独立样本行非参数检验。绘制ROC曲线评估miR-146a、miR-185对恶性胸腔积液的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 良恶性胸腔积液中miR-146a、miR-185的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，miRNA-146a、miRNA-185在恶性胸腔积液中的表达均明显低于良性胸腔积液(P均<0.01)。临床资料也显示良、恶性胸腔积液中的癌胚抗原和CYFRA 21-1浓度间的差异亦有统计学意义(P均<0.01)。见表2。

表2 4种标志物在胸腔积液中的检测值 中位数(范围)

2.2 miR-146a及miR-185在恶性胸腔积液中的表达水平与临床参数的相关性

统计分析显示，在恶性胸腔积液中miR-146a及miR-185的表达水平与患者的年龄、性别、吸烟史、病理分型均无明显相关性(P≥0.05)。见表3。

表3 恶性胸腔积液miR-146a及miR-185表达水平与临床参数的相关性 中位数(范围)

2.3 miR-146a、miR-185与癌胚抗原、CYFRA 21-1在良恶性胸腔积液中诊断价值的比较

ROC曲线显示，miR-146a和miR-185的曲线下面积(AUC)均低于癌胚抗原，但高于CYFRA21-1。miR-146a诊断的敏感度均高于癌胚抗原及CYFRA 21-1，miR-185诊断的敏感性高于CYFRA 21-1，但低于癌胚抗原，而特异性均低于癌胚抗原和CYFRA 21-1。miR-146a、miR-185联合诊断的AUC与单独诊断的AUC相比并无明显提高，取最佳临界值为1 856，其敏感性低于单独诊断，而特异性高于miR-146a，但低于miR-185。联合癌胚抗原能进一步提高两类miRNA诊断恶性胸腔积液的AUC。但两种miRNAs共同联合癌胚抗原诊断恶性胸腔积液的AUC较任一种miRNA联合癌胚抗原无明显上升。见图1、表4。

图1 胸腔积液中各检测标记物诊断的ROC曲线

表4 各种标志物在胸腔积液中的诊断效能评价

3 讨论

本研究结果显示在良、恶性胸腔积液中miR-146a、miR-185表达水平的差异具有统计学意义。ROC曲线显示恶性胸腔积液中miR-146a、miR-185的诊断敏感性均高于经典的肿瘤标志物癌胚抗原、CYFRA 21-1，但两种miRNAs的特异度均低于癌胚抗原、CYFRA 21-1。两种miRNAs中任一种联合癌胚抗原或两种miRNAs共同联合癌胚抗原均能进一步提高对恶性胸腔积液的诊断效能。

Xie等[8-9]利用定量RT-PCR技术于2010年首次发现恶性胸腔积液中miR-24、miR-30d的表达量较良性胸腔积液上调。随后，国内外多项研究均显示miRNAs在良、恶性胸腔积液中存在差异性表达[10-12]。Shin等[13]发现恶性胸腔积液中miR-185的表达水平低于良性胸腔积液，并与临床上常用的肿瘤标志物癌胚抗原进行比较，发现癌胚抗原与miRNA联合应用可提高恶性胸腔积液的诊断效能。该研究结果与本研究结果一致。本实验还发现miR-146a、miR-185在恶性胸腔积液中的表达与患者年龄、性别、吸烟史及临床分型无明显相关性。因此，miR-146a、miR-185有望成为鉴别诊断恶性胸腔积液的肿瘤标志物。

miRNAs的异常表达可发生在多种类型的恶性肿瘤中，其可作用于癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生发展。Wang等[14]研究表明miR-146a在非小细胞肺癌的组织和细胞中均表达较低，充当抑癌基因的作用。该研究发现通过增加miR-146a的表达可以靶向抑制巨噬细胞游走抑制因子的表达水平。实验表明miR-146a经NF-kB信号途径实现抑制肿瘤的增殖并发挥了诱导肺癌细胞凋亡的作用。在胃癌、前列腺癌及乳腺癌等恶性肿瘤中miR-146a显示出抑癌基因的作用[15-17]。Li等[18]发现在肺癌细胞中miR-185的表达显著下调，miRNA-185通过靶向AKT1调节肺癌细胞增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤生长。Qiu等[19]的研究表明胃癌中miR-185呈低表达，其通过调控靶基因TRIM29参与胃癌的形成与发展。Zou等[20]的研究表明miR-185在乳腺癌细胞中低表达，Raf-1激酶抑制蛋白通过上调靶向高迁移率组AT-hook 2的miR-185来抑制肿瘤的增殖和转移。综上，miR-146a、miR-185可通过靶向目的基因参与调控多种肿瘤的增殖、迁移和侵袭，在肿瘤的发生发展中起重要作用。但目前恶性胸腔积液的形成机制尚不明确，miR-146a、miR-185在恶性胸腔积液中低表达的具体机制仍需进一步的研究。

综上，本研究表明，与良性胸腔积液相比，miR-146a、miR-185在恶性胸腔积液中显著低表达。虽然，国内外多项研究发现miRNA在胸腔积液中存在差异性表达[10-12]，但是对同一种miRNA的研究相对较少，即miRNA的重复性仍需要后续研究的验证。本研究虽然显示miR-146a、miR-185有望作为鉴别恶性胸腔积液的非侵入性的标志物，但是临床恶性胸腔积液的确诊仍需要病理学证据。另外，本研究的样本量偏少也可能对实验结果产生偏移，需要大样本进一步验证。

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