快速溶剂萃取-高效液相色谱法联用测定坚果中α维生素E的含量

(北京吉天仪器有限公司，北京 100015)

1 引言

维生素E(VE)，又被称作生育酚，1922年首次由生物学家 Evans 等人在研究老鼠繁殖时发现[1]。因其具有天然抗氧化能力而广泛应用。维生素E是一种脂溶性抗氧化剂，因能够阻断自由基链式反应，从而抑制油脂的氧化[2]，被称为是最有效的抗氧化剂。维生素E包含α、β 、γ、δ 4种生育酚，广泛存在于动植物脂肪、大多数植物油和叶绿植物中，其中α-生育酚的生理活性和抗氧化能力最强[3]。

传统的提取技术包括索氏提取，超声萃取，超临界萃取等技术，但这些技术存在有机溶剂使用量多，萃取时间较长，萃取效率低等不足[4]。郑熠斌[5]等人利用皂化法，使用乙醚-石油醚(V∶V=1∶1)作为提取溶剂，对食品中的维生素E进行提取，该提取方法比较繁琐，自动化程度低；陈燕舞[6]等人利用皂化法使用无水乙醚提取油样中的维生素E，使用溶剂多，操作步骤复杂。

快速溶剂萃取是一种新的萃取技术，在高温高压下，样品与液态溶剂接触，从而能够快速和高效萃取多种样品基质中的分析物。与传统的提取方法(如浸渍、索氏提取法)相比，快速溶剂萃取具有萃取高效、快速的优点，平均萃取时间少于15min。此外，快速溶剂萃取技术广泛应用于分析沉积物、污泥等多个领域中的农药残留、多环芳烃、多氯联苯等污染物[7-9]，已被美国国家环保局(EPA)选为推荐的样品前处理标准方法[10]。

本实验以杏仁为例，采用快速溶剂萃取前处理技术，通过高效液相色谱对萃取的α维生素E(αVE)含量进行测定，并对萃取方法进行优化得出最佳萃取条件，以优化后的条件对生花生，山核桃，杏仁以及葵花籽四种坚果样品进行前处理以及含量的测定。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

APLE-3500快速溶剂萃取仪，配11mL萃取池(北京吉天仪器有限公司)；LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，十万分之一)；TM-2000超级恒温混匀仪(北京吉天仪器有限公司)。

无水乙醇、正己烷、甲醇均为色谱纯，使用前超声脱气；α-VE标准物(北京中标物科技有限公司)。

杏仁、葵花籽、生花生、山核桃样品市购，取可食部分进行样品处理。

2.2 标准曲线配制和色谱图

精确称取α-VE标准品100.0mg，用无水乙醇溶解后，转移到100mL容量瓶中，定容至刻度，得到标准储备液，浓度为1.00mg/mL，于-20℃冰箱中储存。准确吸取标准储备液5.00mL于同一50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到标准中间液，浓度为100μg/mL。准确吸取标准中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配置浓度分别为2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL、60.00μg/mL的α-VE标准溶液。

2.3 样品制备

准确称取粉碎好的坚果样品(生花生、山核桃、杏仁、葵花籽)2.00g，硅藻土和杏仁质量比为1∶1混匀倒入预装纤维素膜的11mL萃取池中，萃取溶剂为正己烷，温度110℃，萃取时间300s，循环两次，萃取结束后将收集瓶中的萃取液全部转移到容量瓶中并定容至10mL，涡旋振荡均匀澄清后，取1mL过0.45μm滤膜，待HPLC分析。

2.4 色谱条件

液相色谱采用二元高压梯度洗脱方式。色谱柱选用了Athena C18柱，4.6×250mm，粒径5μm；流速：0.8mL/min；波长：294nm；进样量：20μL。梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序

2.5 重复性试验

精确吸取20 μL一定浓度的α-VE标准溶液，在2.4色谱条件下进行6次重复实验，在该条件下保留时间的相对标准偏差为0.10%，峰面积的相对标准偏差为0.22%，表明仪器的精密度良好。

2.6 线性范围和检出限

按照2.4的色谱条件，对配制的不同浓度标准系列溶液进行分析，从低浓度到高浓度进样，在线性范围2～100μg/mL的条件下，得出标准曲线为Y=11037.30645X+4764.28303，相关系数r=0.9999，标准曲线如图1所示，α-VE的质量浓度与其峰面积线性关系良好。α-VE标样(40μg /mL)的高效液相色谱图见图2。以3倍信噪比确定最低检出限，检出限为0.04μg/mL。

图1 α-VE标准溶液的线性曲线

图2 α-VE标准溶液色谱图(40 μg/mL)

2.7 方法回收率实验

选取杏仁作为基质样品，根据2.3样品制备和萃取条件，并加入一定量的α-VE标准溶液，考察α-VE的加标回收情况。实验结果表明加标回收率均符合日常分析检测的要求，α-VE的加标回收率详见表2。

表2 加标回收率实验

2.8 样品测定

根据2.3萃取条件和2.4色谱条件，分别测定市购的4种坚果中α-VE含量，结果如表3。从表中可以得出，坚果中含有丰富的α-VE。4种坚果的液相色谱图如图3所示，峰分离良好。

表3 不同坚果α-VE的测定

图3 不同坚果中α-VE的液相色谱图

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

参考苏琨[11]等人的工作，本实验选用Athena C18柱(4.6×250mm，5μm)作为色谱分离柱。通过查阅资料发现，甲醇和水作为流动相对于分离α-VE是相对合适的溶剂，在甲醇∶水(96∶4)的条件下，分离得到的α-VE得到的峰形尖锐良好，以及在样品中干扰物能够得到较好的分离，流速设为0.8mL/min时，α-VE出峰时间合适，干扰少，在294nm 处有最大吸收峰，根据以上色谱条件进样，标准溶液以及实际样品的色谱图如图2和图3所示。

3.2 提取溶剂的选择

实验以杏仁为对象，对样品萃取溶剂进行了考察，通过查阅资料发现，常用正己烷、甲醇、无水乙醇溶剂对α-VE进行萃取[11]。分别称取2.00g杏仁样品与等量硅藻土混匀，并将其填入萃取池内，在设置温度为110℃，静态循环1次，萃取时间300s的条件下，分别用上述不同溶剂进行萃取，计算收集液α-VE的提取量。实验结果如图4所示，当提取溶剂为正己烷和甲醇时，对杏仁中α-VE提取量相差不多。在甲醇、无水乙醇以及正己烷这3种溶剂中，正己烷沸点最低，在后续氮吹浓缩过程中挥发速度最快，容易去除，所以本实验选择正己烷作为萃取溶剂。

图4 萃取溶剂对α-VE提取量的影响

3.3 萃取温度的优化

萃取温度是快速溶剂萃取的重要参数。高温有利于萃取效率的提高，温度增加，溶剂粘度降低，溶剂对基质的浸润能力增强，溶剂对分析物质的溶解能力增大。而且高温能够加速分析物向基质表面的扩散速度，萃取效率从而得到提高。

分别称取2.00g杏仁样品与等量硅藻土混匀，置于11mL萃取池当中，以100%正己烷为萃取溶剂，对90，110，130，150℃4种不同萃取温度进行了考察，萃取参数如下：静态萃取时间300s，循环次数1次。然后按2.4色谱条件对杏仁中的α-VE进行分析测定。如图5结果表明，当温度低于110℃时，α-VE的提取量随温度的升高而增加，温度为110℃时，α-VE的提取量最高，达到3.74μg/g；当温度高于110℃时，提取量随温度升高而降低。造成此现象的原因可能是由于温度过高，热溶剂的蒸发导致提取量降低。综合考虑，实验确定110℃为最佳萃取温度。

图5 不同萃取温度对α-VE提取量的影响

3.4 萃取时间的优化

萃取时间的长短与样品中待提取成分在溶剂中扩散程度有关，增加萃取时间有利于待萃取物质从样品基质扩散到提取溶剂中。本实验以100%正己烷为提取溶剂，提取温度为110℃，对60、100 、300 、480s 不同萃取时间进行了考察，然后按2.4色谱条件进行α-VE的含量进行测定。实验结果如图6所示，随着萃取时间的增加，杏仁中α-VE的提取量先出现增加的趋势，萃取时间达到300s时，α-VE的提取量最大，当时间为480s时，同300s比较，提取量基本不变。可以得出，当静态萃取时间为300s 时，α-VE的提取量达到最大值，故本实验选择300s 作为静态萃取的最佳时间。

图6 不同萃取时间对α-VE提取量的影响

3.5 萃取循环次数的优化

分别取均匀试样2.00g与等量硅藻土混匀，置于萃取池内，正己烷为萃取溶剂，在温度110℃，静态萃取时间300s的条件下，分别萃取1、2、3次，计算萃取液中α-VE提取量，实验结果如图7所示，静态循环2次即可达到较好的提取量，继续增加循环次数提取量没有显著增加,所以实验确定最佳萃取次数为2次。

图7 循环次数对α-VE提取量的影响

4 结论

采用快速溶剂萃取技术萃取坚果(生花生，山核桃，杏仁以及葵花籽)中的α-VE，并以杏仁为例对萃取工艺条件进行优化。快速溶剂萃取技术自动化程度高，操作简单方便，通过优化后的方法与传统方法比较萃取所需溶剂少，萃取时间短，对α-VE的提取效率高。实验通过高效液相法对提取的α-VE进行检测，峰形良好，加标回收率为90.1～97.2%之间。本研究使用的快速溶剂萃取技术快速高效，为提取研究食品中的维生素E提供新的方法。

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