子宫内膜全层切除法构建SD大鼠 宫腔粘连模型的效果评价

陈 芳 郭奇桑 陈丽梅 江宁红 隋 龙,△

(1复旦大学附属妇产科医院宫颈疾病诊疗中心 上海 200011; 2上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室 上海 200011)

宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)又称为Asherman综合征,1948年由Asherman首次详细报道[1],是由于子宫内膜损伤导致子宫内膜瘢痕纤维化及修复障碍,宫腔部分或全部粘连闭塞从而引起一系列临床症状的一种妇科常见病。近年来,随着频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及,IUA的发病率和检出率逐年上升,成为女性继发不孕的第二大病因[2-3]。目前认为,创伤和感染是IUA发生的主要高危因素,任何引起子宫内膜基底层脱落、缺失使得肌层暴露的损伤均可导致子宫内壁相互粘连,子宫内膜前后壁基底层破坏是粘连发生的必要条件[4-5]。IUA导致的不孕、反复流产、月经减少甚至闭经等一系列临床疾病的治疗一直是国内外妇产科医生面临的棘手问题。IUA病理机制尚不明确[6],目前主要治疗方法为尽可能恢复宫腔解剖形态,然而粘连部位子宫内膜生理功能的恢复尚不明确,远期疗效不肯定,且IUA的治愈率和妊娠率尚无明显改善[7]。因此,有必要建立一个稳定的接近人类IUA发病原因的IUA动物模型,以利于更加深入研究其发病机制及病理生理,为子宫内膜损伤和IUA的实验研究和临床治疗寻找契机与手段。本实验采用子宫内膜全层切除法,以期建立一种更符合人体子宫内膜机械性损伤的IUA大鼠模型。

材 料 和 方 法

主要材料

动物来源 清洁级成年雌性SD大鼠105只,6～8周龄,体重200～250 g,购自上海斯莱克实验动物责任有限公司[SCXK(沪)2012-003],动物由复旦大学附属妇产科医院动物实验中心饲养。饲养饮条件:每5只合并一笼,室温21～22 ℃,湿度67%～75% ,自由摄水。

试剂和仪器 LEICA显微镜(德国Leica公司)、石蜡切片机(金华市益迪医疗设备厂)、Masson 染色试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、戊巴比妥钠、显微手术器械(上海金钟器械厂)、医用7-0缝线(上海强生公司)、羊抗鼠CD31一抗(美国Abcam公司)和兔/鼠通用型免疫组化试剂盒[基因科技(上海)有限公司]。

造模方法

实验动物分组 105只大鼠根据损伤范围的不同随机分为A组(2.5 cm×0.5 cm,即全周径子宫内膜切除)、B组(2.5 cm×0.25 cm,即半周径子宫内膜切除)和C组(假手术,只做切口不切除内膜),每组35只大鼠。

造模步骤 取6～8周龄雌性SD大鼠适应环境1周,术前禁食1晚,按2%戊巴比妥钠0.3 mL/100 g体重,腹腔注射麻醉,固定大鼠。剃除下腹部皮肤毛发,75%乙醇消毒。在无菌手术操作台中于耻骨联合上方2～3 cm处纵向切开腹壁皮肤2.5 cm,逐层切开组织,进入腹腔,缓慢挑出大鼠的Y型子宫,A、B两组双侧宫角同时手术,左侧宫角为造模侧,右侧宫角为自身对照(只做切口,不损伤内膜),C组左侧宫角只做切口不切除内膜,右侧宫角不处理。眼科直剪于子宫中段正中央纵向剪开长2.5 cm切口,保留子宫系膜完整,眼科弯剪垂直于子宫纵切口,逐个部位将子宫内膜剪除,彻底去除子宫内膜全层,深度控制在不突破子宫浆膜面,即确保子宫浆膜面的完整性,剪除直至子宫壁菲薄半透明为止。B组以子宫系膜为界,只去除1/2宫腔面积的子宫内膜。子宫内膜切除完成后,无菌纱布彻底止血,7-0缝线间断缝合子宫,将子宫还纳至腹腔,生理盐水冲洗腹腔,关腹。C组只沿子宫中段做相同长度纵切口,不切除子宫内膜(图1)。

A:Bilateral uteruses in rat after opening the abdomen;B:A longitudinal incision about 2.5 cm along the uterus was made;C:In the surgery of endometrial resection,endometrium had not been completely removed;D:Bilateral uteruses were made in the same modeling method.

图1大鼠子宫内膜切除术步骤
Fig1Thestepsofendometrialexcisioninrats

取材处理 各实验组造模后按时间点3、7、15和30天分别处死5只大鼠取材,以C组子宫作为对照组。取材后记录子宫狭窄、堵塞情况,4%多聚甲醛固定组织,行石蜡包埋、切片,分别行HE、Masson及CD31染色。

子宫内膜腺体数量、纤维化面积比、微血管密度(micro vascular density,MVD)测定方法 显微视野选择方法:A造模组和C假手术组随机选取内膜处视野进行拍摄,B造模组则在切除内膜一侧选取视野,3组选取视野的放大倍数相同。HE染色观察子宫内膜造模后腺体数量:每张HE染色切片选取6个低倍镜视野(×40),计算每个视野下腺体的数量,取其平均值。Masson染色计算纤维化面积比率:每张Masson切片选取8个高倍镜视野(×200),纤维化面积比率为每个视野子宫内膜间质纤维化(胶原染色阳性面积)的总面积除以子宫内膜间质和腺体面积(整个视野面积)的总和,取平均值,以Image Proplus图像分析软件自动计算完成,评估造模后子宫内膜损伤和IUA的形成情况;CD31染色计算MVD,评价子宫内膜损伤及血供情况。

子宫腔通畅性评分方法 评分标准:将造模术后30天的大鼠子宫置于白色滤纸上,1 mL注射器从子宫卵巢端向大鼠宫腔内推入同等体积(约0.5 mL)的亚甲蓝溶液。根据推入液体所需的力度及滤纸上蓝色区域面积大小综合评分,分为3个等级(图2)。子宫通畅,计为0分;子宫通而不畅,计为1分;子宫完全不通畅,计为2分。IUA评估包括子宫内膜纤维化面积比率和宫腔通畅性两个变量,将每只大鼠以上两个参数评分相加,得到大鼠造模30天后子宫内膜纤维化总评分,评分越高提示IUA程度越重。

图2 C组SD大鼠子宫腔通畅性评估Fig 2 Uterus patency evaluation of group C

妊娠率评估 造模术后12周,每组剩余15只大鼠与成年雄性SD大鼠连续合笼交配过夜,以合笼后第2天阴道图片见精子为妊娠第1天,同时观察雌鼠体重及腹形变化,于妊娠中晚期开腹探查受试雌鼠双侧子宫的受孕情况,统计每组孕鼠个数及孕囊或胚胎的数量,从第1天合笼时间开始至30天交配实验完全结束。

结 果

观察造模后子宫内膜形态学改变子宫内膜全层切除术后3天,A组和B组大鼠子宫病理组织学均表现为内膜上皮细胞大范围脱落缺失,局部仅少量残存上皮附着;子宫内膜间质水肿明显,间质成分减少;残余间质内毛细血管破裂、出血,伴有大量中性粒细胞浸润(图3),其中A组残存的子宫内膜间质成分和腺体数量较B组明显减少。造模后7天,A组子宫内膜上皮再生不明显,几乎无腺体再生,间质纤维化明显,大量胶原蛋白形成,粘连致使大鼠子宫管腔完全粘连闭合(图4);B组子宫内膜扁平腺上皮不同程度再生,间质充血水肿逐渐减轻,间质纤维化增生不明显,无明显IUA形成或宫腔闭合(图5)。造模后15天,A组损伤达肌层、无上皮间质附着的子宫内膜基本无腺上皮再生,而残存少量间质和上皮组织的内膜腺上皮层开始逐渐恢复,上皮下少量腺体再生,间质仍可见轻度充血、水肿,淋巴细胞浸润,部分子宫可见IUA或有粘连带形成,腺体稀疏,间质纤维化明显;B组腺上皮再生,内膜间质仍比正常对照侧稀薄,有纤维组织增生。造模后30天,A组子宫内膜间质纤维化,部分子宫内膜呈萎缩状态,仍可见子宫内膜上皮细胞全层缺失,间质稀薄或仅有少量间质残存;局部子宫肌层裸露,无间质及上皮附着;部分子宫肌层缺失,仅有少数子宫内膜上皮可再生,间质修复困难;B组子宫内膜上皮基本恢复,间质再生,部分纤维组织形成(图6)。

本实验中观察到采用A造模法造模后30天,大鼠子宫内膜呈萎缩状态,无粘连形成(图6 A)共2

图3 A、B组子宫内膜切除术后3天Masson染色Fig 3 Masson’s trichrome staining of endometrium 3 days after surgery in group A and B

图4 A组子宫内膜切除术后7天Masson染色Fig 4 Masson’s trichrome staining of endometrium 7 days after surgery in group A

图5 B组子宫内膜切除术后7天Masson染色Fig 5 Masson’s trichrome staining of endometrium 7 days after surgery in group B

例,病理学表现为:子宫内膜腺体消失,零星散在管腔闭锁的微血管,MVD和纤维化面积比率均较A组其余样本低。提示A造模术式对子宫内膜损伤较为彻底,采用子宫内膜全层切除法造模后可形成IUA模型和子宫内膜萎缩模型。

造模后子宫内膜腺体数量统计A组各时间点腺体数量明显少于其余2组(P<0.00 1),差异具有统计学意义;B、C两组相比较,差异无统计学意义(P=0.054),其中B组腺体数量在造模术后15天恢复至C组水平;A、B两组相比较,A组腺体数量低于B组,随时间变化,A组腺体数量仅呈缓慢增长,至术后30天,仍然不能增长至C组水平。由此说明,A组造模术式对子宫内膜造成的损伤较为彻底(图7)。

图6 A和B组子宫内膜切除术后30天Masson染色Fig 6 Masson’s trichrome staining of endometrium 30 days after surgery in group A and B

A:2.5 cm×0.5 cm;B:2.5 cm×0.25 cm;C:Sham operation.The same in the other figures and tables.

图7A、B、C组腺体数量比较
Fig7ComparisonofglandquantitybetweengroupA,BandC

造模后CD31标记的子宫内膜MVD统计A、B模型组与C假手术组MVD相比较,A组各时间点MVD明显低于其余2组(P均<0.000 1);B、C两组差异无统计学意义(P=0.303);A组MVD明显低于B组,且随着时间的增长,A造模组MVD增长缓慢,各时间点相比较,差异无统计学意义(P=0.543),A造模组MVD水平至术后30天,明显低于B、C两组(图8、9)。

子宫内膜纤维化面积比率和子宫腔通畅性评分子宫内膜Masson染色后胶原纤维显微镜下呈蓝色,排列较整齐,血管和肌肉呈暗红色(图10),A、B、C组造模术后30天,A组有大量纤维组织形成, 胶原纤维弥漫子宫内膜间质;B组亦有较多量纤维组织形成,子宫内膜切除面胶原聚集,少量腺体及新生毛细血管形成。C组纤维组织成分少,仅有少量的胶原纤维分布。子宫内膜纤维化面积比率比较,A造模组高于B、C两组(P<0.01),B造模组高于C组(P<0.05)。各组子宫通畅性评分比较,A组显著高于C组,A、B、C组两两相比较(PA,B=0.05,PB,C<0.05,PA,C<0.001),均有统计学意义(表1)。

图8 A、B、C组子宫内膜免疫组化CD31染色(×400)Fig 8 The immunohistochemical staining CD31 of endometrium in group A,B and C (×400)

图9 A、B、C造模组MVD比较Fig 9 Comparison of MVD between group A,B and C

子宫内膜全层切除模型鼠妊娠率情况以大鼠左侧子宫为A、B造模侧,右侧子宫采用假手术作为自身对照,造模后3个月与雄鼠合笼,孕囊数和妊娠率的统计方法:观察并统计A、B、C各组造模单侧宫角(即左侧宫角)的孕囊数量,并进行组间比较,自身对照侧(即右侧宫角)的孕囊数量不纳入统计。图11采用A造模法造模,A图为造模术后1个月IUA实体图,见术后IUA闭塞并形成积液,对侧子宫未见明显粘连。B图为术后3个月与雄鼠合笼后妊娠情况,大鼠左侧子宫孕囊数量较对侧明显减少。从表2可知,A组术后IUA率为60%,高于B组和C组(P<0.001),而妊娠率仅为20%,均低于B、C两组(P<0.05)。

The three pictures in the first line were taken on the edge of the endometrium,while the others in the second line were taken in the middle of the endometrium.

图10A、B、C造模组术后30天子宫内膜Masson染色比较(×400)
Fig10Masson’strichromestainingofendometriumgroupA,BandC30daftersurgery(×400)

GroupThe ratio of fibrosis areaUterus patency A0.89±0.071.87±0.16 B0.56±0.031.20±0.17C0.37±0.070.68±0.10

The ratio of fibrosis area:PA,B<0.01,PA,C<0.001,PB,C<0.05;Uterus patency:PA,B=0.05;PB,C<0.05;PA,C<0.001.

R:Right;L:Left.

图11A模型鼠造模术后IUA(A)及妊娠(B)情况
Fig11TheIUAperformance(A)andpregnancy(B)ofratingroupA

表2大鼠IUA模型子宫妊娠率

Tab2PregnancyrateinIUAmodelsofrats(n=15)

Pregnancy rate:PA,B<0.05,PA,C<0.001,PB,C=0.01.

讨 论

IUA引起的闭经、继发不孕、反复流产或前置胎盘、胎盘植入等产科并发症严重影响了女性的身心健康[8-9],也是国内外妇产科医师长期以来棘手的医学难题。IUA分解术虽能一定程度改善内膜条件,但总体治愈率和妊娠率无明显提高,IUA的内膜修复机制到目前为止尚不明确,因此,临床研究中亟需寻找到合适的IUA动物模型,以提供理想的实验基础,指导IUA疾病的治疗,为实现“人人享有生殖健康”的奋斗目标迈进一步。

本实验经过研究对比,选取大鼠作为造模动物,大鼠具有双子宫双宫颈单阴道的特殊解剖结构,两侧子宫不相通,其双子宫结构可形成自身对照,是IUA造模动物的良好选择对象。迄今为止,IUA的动物造模方法主要有物理方法、化学方法和生物方法3类:物理方法包括机械损伤[10-12]、电凝损伤[13]及热盐水损伤[14]等;化学方法主要使用0.4%甲醛溶液及无水乙醇等行宫腔注射[15];生物方法包括宫腔内成纤维细胞移植[16]及脂多糖感染联合机械损伤法[17]。

以上方法均能一定程度上造成子宫内膜损伤,形成内膜纤维化及IUA,但IUA最主要的病因为刮宫后的内膜基底层损伤[18]。研究报道指出,妊娠期宫腔操作引起的IUA高达91%,其中66.7%源于人工流产或自然流产后的刮宫,21.5%源于产后出血[19]。物理方法中电凝损伤或热盐水损伤导致的子宫内膜凝固型坏死和化学方法导致的子宫内膜腐蚀性炎性坏死,与临床上机械性损伤后的修复反应不同,不适合用于IUA 的子宫内膜再生功能的研究,本研究采用机械性损伤方法旨在为子宫内膜损伤后的再生修复研究提供有效的动物模型。

如上所述,创伤是IUA发生的主要病因[20-21]。子宫腔由前壁、后壁及周围侧壁所组成,单独某一壁的损伤不足以导致整个宫腔的粘连闭塞,损伤面积越大,内膜再生能力越差,IUA形成的概率越高。因此,本研究依据IUA发生的高危因素,根据不同的子宫内膜切除面积将实验组分为全周径子宫内膜全层切除组和半周径子宫内膜全层切除组,构建IUA大鼠模型。

本实验前期预实验中采用单纯搔刮法损伤大鼠子宫内膜,证实单纯性机械搔刮法不足以彻底损伤子宫内膜基底层。SD大鼠子宫内膜在机械搔刮后3天起内膜腺上皮细胞即开始再生,7天子宫内膜组织完全再生,术后28天间质部位仅有轻微纤维化改变,子宫内膜上皮的形态学基本恢复,宫腔基本无粘连带形成。说明单纯搔刮法对子宫内膜上皮再生影响较小,无法构建满意的大鼠IUA模型。而实验组在此基础上改进的子宫内膜全层切除法能较为彻底地切除子宫内膜腺上皮及绝大部分间质,引起SD大鼠的子宫内膜全层损伤,构建出满意的大鼠IUA模型,且该模型与人体刮宫导致的IUA较为接近。

本研究显示,相比于半周径子宫内膜全层切除法,全周径切除法造模后纤维化评分和IUA形成率更高,胚胎着床率更低,具有明显的统计学意义,该实验进一步证实子宫腔内壁的损伤面积越大,内膜再生能力越差,IUA形成的概率越高。另外,本研究还发现,采用子宫内膜全层切除法构建IUA模型过程中,损伤深度控制尤为重要,当损伤深度达子宫内膜基底层时,切除绝大部分间质和腺上皮组织,仅残留少量腺上皮时,较易构建成宫腔粘连模型(图3),此模型适用于内膜损伤后防粘连措施的效果评价;而当损伤深度达子宫浅肌层甚至深肌层,子宫内膜层几乎完全被切除时,则反而不易形成IUA,如图5所示,造模后30天观察,仍见子宫内膜萎缩,无法生长,此模型适用于子宫内膜再生修复的研究,如干细胞再生修复。本实验中A、B、C各组造模后分4个时间点进行观察:3、7、15和30天,3组模型中每个时间点均有5只大鼠,每组共20只大鼠用于形态学观察。造模术后30天不形成粘连,组织病理学表现如图5所示的实际样本数仅有A模型组中的2例,其组织学表现为腺体消失,高倍镜下可观察到零星散在的微血管,同时纤维化程度较A组其余样本明显小。这2例子宫内膜萎缩模型均在A造模组术后30天观察到,其余时间点未见,因此,A组出现内膜萎缩的比例为40%,IUA的比例为60%,由此说明A造模术式对子宫内膜损伤较为彻底,采用子宫内膜全层切除法造模后可形成IUA模型和子宫内膜萎缩模型。分析可能的原因有:(1)与子宫内膜切除程度相关,当内膜切除较为彻底时,因残留的间质成分少,无明显纤维蛋白形成,子宫内膜术后30天则表现为萎缩状态,不形成粘连;(2)与不同时期病理变化不同有关,子宫内膜切除法造模后30天之前的病理表现可能主要以纤维化为主,而造模30天后以子宫内膜萎缩为主。这与组织再生修复过程相关,造模后3天为急性炎症期,7～15天为纤维化形成期,造模后30天,损伤部位过深的内膜虽然可由周边内膜爬行覆盖,但因局部微血管密度低,缺乏血供,从而逐渐萎缩。该实验进一步表明不孕症的机制除了与IUA有关,还可能与子宫内膜的萎缩、稀薄有关,正如临床上刮宫后导致的不孕,并不一定都是由IUA造成的,也有可能与子宫内膜萎缩、不生长有关。

目前,IUA动物模型的造模方法及模型评估尚无统一标准。在动物造模过程中,造模后分不同时间点评估内膜损伤后的形态学改变,进行IUA形态学评分及纤维化半定量评分,并评估妊娠结局,是目前较为常用的模型评估方法。综合以上实验结果,本研究采用子宫内膜全层切除法建立了较为满意的大鼠IUA模型,该模型的建立可以从基因、蛋白以及干细胞等多个层面深入研究IUA的发病机制,并且可以作为一个平台从细胞因子、生物材料以及干细胞移植等方面探求新的治疗方法并检测其有效性及安全性。对研究临床IUA发病机制及防治方法具有积极意义。

由于大鼠的子宫结构与人类差异较大,且相同品系动物间仍存在异质性,如何选择更为合适的动物或更为优良的造模方法,建立标准化动物造模流程,使损伤后的子宫内膜病变程度更具标准性和可控性,值得进一步探索。与生物及化学造模方法相比较,本实验采用的子宫内膜全层切除法尚存在一定的不足:没有统一切除标准,具有一定经验性,对子宫内膜切除深度的控制以及内膜去除的彻底程度因实验者操作熟练程度的不同而具有一定差异。因此,本实验造模全部由一人完成,通过大量的训练以及扩大样本量来降低组内和组间误差,后续如何建立统一化的造模标准,尚待进一步探索与研究。

参 考 文 献

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