COL3A1促进结直肠癌生长及潜在调控机制

2018-06-07 12:59
复旦学报(医学版) 2018年3期
关键词:细胞系结肠癌克隆

王 颉 刘 锋

(复旦大学生物医学研究院医学系统生物学研究中心 上海 200032)

结直肠癌是最常见的一类消化系统恶性肿瘤,发病原因复杂,由多种因素共同影响,位居我国恶性肿瘤发病率第4位,死亡率第5位[1-2]。由于尚未发现有效的诊断方法,难以早期准确诊断结直肠癌,当患者由于明显的腹部病症而确诊时大多数已到中晚期[3]。

COL3A1作为一种Ⅲ型胶原,主要存在于细胞外基质中,在人体内皮肤、血管内膜、肌肉等结缔组织中含量丰富。Ⅲ型胶原缺乏会导致机体内与结缔组织相关的结构穿孔、撕裂、折断甚至破碎[4-6]。COL3A1基因全长约44 kb,共有52个外显子,位于人2号染色体q24.3~q3区域。COL3A1基因存在明显的多态性,具有多种等位基因[7]。COL3A1基因多态性及表达量与动脉瘤的发生发展密切相关,COL3A1表达失衡将会导致动脉瘤样的扩大从而严重影响患者的生存率[6]。肺部成纤维细胞中COL3A1高表达将会增加癌变风险[8-9]。COL3A1的膜上受体GPR56与其相互作用可抑制神经元的移行,并且GPR56下调表达可促进黑色素瘤细胞的转移[10-13]。部分小分子RNA(如mir-29 a、mir-29b、mir-29c、let-7d)以COL3A1为靶向分子参与肿瘤的发生发展[14-19]。与配对的正常组织相比,结肠癌中COL3A1的转录水平明显增高,且转录水平随肿瘤恶化程度的增高而增加,表明COL3A1和肿瘤的发展相关。

我们研究发现,与结肠癌肿瘤组织的中心区域和正常组织相比,结肠癌肝转移的边缘组织中COL3A1表达量显著增加,COL3A1可能在肿瘤转移过程中发挥作用。COL3A1在肿瘤发展过程中的作用和机制尚未得到明确阐释,COL3A1高表达与临床病理参数及预后的关系需要进一步探索。本文旨在进一步了解COL3A1蛋白在结直肠癌增殖过程中的作用,为结直肠癌的诊断治疗提供支持。

材 料 和 方 法

主要实验仪器CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);多功能酶标仪Synergy H4 (美国BioTek公司);细胞计数仪(美国Beckman Coulter公司);电泳系统(美国Bio-rad公司);LAS-3000成像系统(日本Fujifilm株式会社);倒置拍照显微镜DP70 (日本Olympus株式会社)。

材料和试剂人结直肠癌细胞系Lovo、HCT116、SW480、SW620、Hela及HEK293T细胞(中国科学院上海细胞库);细胞培养皿/板(美国Corning公司);细胞培养基DMEM高糖、DMEM/F12、低血清培养基Opti-MEM及胎牛血清(美国Gibco公司);0.25%胰蛋白酶及Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司);限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶及PCR聚合酶(美国NEB公司);感受态细胞DH5α(北京天根生化科技有限公司);PCR产物回收试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及质粒小抽试剂盒(德国QIAGEN公司)。

细胞培养HCT116、SW480、SW620、Hela及HEK293T细胞系使用DMEM高糖培养基培养,Lovo细胞使用DMEM/F12培养基培养,所有细胞培养基含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

瞬时过表达载体pcDNA3.1A-COL3A1构建及扩增使用pcDNA3.1A构建COL3A1表达载体,通过NCBI在线数据库获取COL3A1[Homo sapiens (human),Gene ID:1281]序列,根据载体信息,设计酶切位点,合成引物,pcDNA3.1-COL3A1-F:5’-CTAGCTAGCTAGATGATGAGCTTTGT-GCAAAA-3’;pcDNA3.1-COL3A1-R:5’-ATTTG-CGGCCGCTTTATTATAAAAAGCAAACAGGG-C-3’。使用人正常成纤维细胞系CCD18CO全cDNA为模板,经PCR后进行产物回收,对PCR回收产物和空载体进行双酶切并连接,随后转染DH5α感受态细胞,涂板培养并进行菌落PCR,挑选阳性菌落测序验证,测序正确后扩大培养,待菌液D600达到0.5~0.8时提取质粒,保存并备用。

siRNA瞬时干扰基因表达实验使用siRNA对贴壁肿瘤细胞系进行瞬时基因表达干扰操作。siRNA序列如下:si1正义链,5’-GCUGAAGGAA-AUAGCAAAUTT-3’;si2正义链,5’-CGGUCCU-AAAGGAAAUGAUTT-3;si3正义链,5’-CCUG-GUGGUAAAGGCGAAATT-3’;阴性对照(NC)正义链,5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。将转染试剂与siRNA溶液加入Opti-MEM降血清培养基中,轻轻混匀,室温静置20 min后滴加到细胞培养板中,继续培养48 h。

MTT法检测细胞增殖实验取对数生长期状态良好的待处理细胞,胰蛋白酶消化计数;按实验需求使用完全培养基稀释并重悬细胞,以每孔1 000个细胞数接种于96孔板中,共接种5块板,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中持续培养,每天取出1块板,加入20μL MTT工作液(5 mg/mL),37 ℃孵育4 h后去除上清,加入200μL DMSO,震荡溶解10 min。酶标仪在490 nm波长下测定吸光度(D),绘制细胞生长曲线,连续检测5天。

平板克隆形成实验取对数生长期状态良好的待处理细胞,胰酶消化计数,按实验需求使用完全培养基稀释并重悬细胞,以每孔200个细胞接种于6孔板中,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中持续培养,2周后去除培养基,PBS溶液洗涤3遍,使用0.05%结晶紫溶液染色15 min,PBS溶液洗涤3遍,自然干燥后拍照记录,计算细胞克隆数目。

Westernblot检测当对数生长期细胞至90%汇合度时,去除培养基,使用预冷PBS溶液洗涤2次,加入SDS细胞裂解液冰上裂解20 min,提取蛋白质并使用BCA法进行蛋白质定量。进行SDS-PAGE并转膜后孵育抗体,ECL化学发光检测抗体。

统计学方法所有数据采用SPSS 11.0软件进行统计处理。对照组与实验组间采用t检验,差异显著性检验水平设为双尾0.05。

结 果

COL3A1调控细胞的增殖及克隆形成使用siRNA瞬时干扰及瞬时过表达载体转染结直肠癌细胞系HCT116、SW480、SW620,下调或上调COL3A1蛋白质水平(图1)。

Lane 1:pcDNA3.1;Lane 2:pcDNA-COL3A1;Lane 3:NC-COL3A1;Lane 4:si-COL3A1.

图1在结肠癌细胞系HCT116、SW480和SW620中瞬时沉默及过表达COL3A1的Westernblot结果
Fig1WesternblotresultsoftransientsilencingandoverexpressionofCOL3A1incoloncancercelllinesHCT116,SW480andSW620

在结直肠癌细胞系HCT116、SW480及SW620中,使用siRNA瞬时干扰COL3A1表达,并进行MTT实验,结果发现与转染阴性对照相比,下调COL3A1表达将抑制肿瘤细胞增殖(HCT116,P=0.014;SW480,P=0.007;SW620,P=0.005;图2)。

在结直肠癌细胞系HCT116、SW480及SW620中,使用siRNA瞬时过表达COL3A1,并进行MTT实验,结果发现与转染空载体相比,上调COL3A1表达将促进肿瘤细胞增殖(HCT116,P=0.003;SW480,P=0.010;SW620,P=0.014;图3)。

使用siRNA瞬时干扰或瞬时过表达改变结肠癌细胞系中COL3A1表达水平,在SW480及SW620中进行平板克隆实验,结果发现下调COL3A1表达可显著抑制肿瘤细胞克隆形成,而上调COL3A1表达可显著促进克隆形成(图4)。以上结果表明COL3A1能够调控结直肠癌细胞的增殖。

COL3A1通过调控激活细胞Akt/mTOR通路促进肿瘤细胞的增殖Akt及mTOR处于多条信号通路的重要交叉点,在真核生物的调控网络中普遍存在,与多种疾病的发生发展密切相关[20]。Akt/mTOR信号通路的激活可显著影响肿瘤细胞的生长、增殖、分化及细胞周期调控等[21-23]。COL3A1蛋白质水平提高将显著促进细胞的增殖能力,在HCT116、SW480及SW620细胞中过表达COL3A1,同时使用siRNA干扰COL3A1表达,Western blot检测结果发现,过表达COL3A1激活Akt/mTOR信号通路,其中的关键分子mTOR、AKT和PDK1磷酸化程度显著增高,同时促进下游基因p21和P70S6K的表达;而COL3A1沉默后,mTOR、AKT及PDK1磷酸化程度显著降低,同时抑制下游基因p21和P70S6K的表达(图5)。

讨 论

肿瘤微环境是肿瘤组织发生发展过程中所处的局部病理环境,该区域是癌细胞与非癌细胞成分之间相互作用的场所。肿瘤微环境由包括基质细胞及其所分泌的生化分子在内的非癌细胞成分所构成[24]。胶原分子是细胞外基质的主要成分之一,微环境中的基质成分与肿瘤细胞相互作用,随着肿瘤的进展,胶原分子在基质中重组并呈现出相关动态变化特征。在胃癌细胞中,COL1A1及COL1A2表 达量上调并可作为预测胃癌的潜在分子标志物[25];在结肠癌细胞中,COL6A3可促进肿瘤细胞增殖,并与患者预后密切相关[26];COL1A1可促进胃癌细胞的增殖与移行[27];在纤维化肝癌细胞中,ⅩⅧ型胶原是一种Wnt/β-catenin信号通路的胞外抑制剂,其免疫反应与活化的Wnt信号负相关,能够在胞外与Wnt3α相互结合从而抑制Wnt依赖的β-catenin信号的活化[28]。

图2下调COL3A1表达可抑制细胞增殖
Fig2Down-regulationofCOL3A1expressioninhibitedcellproliferation

图3上调COL3A1表达可促进细胞增殖
Fig3Up-regulationofCOL3A1expressionpromotedcellproliferation

图4下调COL3A1表达可抑制细胞克隆的形成
Fig4Down-regulationofCOL3A1expressioninhibitedcellcolonyformationability

Lane 1:NC-pcDNA3.1;Lane 2:pcDNA3.1-COL3A1;Lane 3:NC-si;Lane 4:si-COL3A1.

图5COL3A1激活AKT/mTOR信号通路
Fig5COL3A1activatestheAKT/mTORsignalingpathway

COL3A1在乳腺癌、头颈部肿瘤、肾癌、肺癌、结直肠癌中高表达,但其在膀胱癌、某些结直肠癌及部分淋巴瘤中存在下调趋势,这提示COL3A1在不同肿瘤中可能存在不同的功能,甚至在同一种类型肿瘤中COL3A1可能在肿瘤的不同发生阶段也会产生不同的作用。有研究显示COL3A1 在mRNA水平的上调将缩短结直肠癌患者的生存期,同时结直肠癌上皮细胞中COL3A1的高表达可导致患者的不良预后。部分研究结果表明COL3A1的mRNA和蛋白质可以作为结直肠癌的预后指标,COL3A1 mRNA及结直肠癌上皮特异表达的蛋白质水平的增高将增大结直肠癌患病风险[19,29-31]。本研究结果发现内源过表达COL3A1能够显著促进结直肠癌细胞系HCT116、SW480和SW620的生长,平板克隆形成的实验结果证实COL3A1对肿瘤细胞的促增殖能力,使用siRNA干扰COL3A1的表达后,肿瘤细胞增殖能力减弱。

我们通过Western blot分析发现,瞬时过表达COL3A1后,mTOR、AKT、PDK1及下游分子p21蛋白质水平均有明显上升。前期的研究也发现,在稳定沉默COL3A1后,AKT及mTOR的磷酸化程度明显降低,由此认为在肿瘤细胞中,COL3A1通过AKT/mTOR磷酸化信号通路发挥作用。这种具有促增殖作用的生物大分子是如何调控Akt/mTOR通路还需进一步研究。

参 考 文 献

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