滇中不同植被类型土壤甲烷氧化及其碳同位素分馏特征

张晓艳，徐华，马静，刘梅先

1. 湖南第一师范学院，湖南 长沙410205；2. 土壤与农业可持续发展国家重点实验室//中国科学院南京土壤研究所，江苏 南京 210008；3. 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙410125；4. 中国科学院环江喀斯特生态系统观测研究站，广西 环江 547100

全球变暖是备受关注的环境问题。特别是近些年来，全球范围内极端气候事件的频发，进一步促使人们关注和研究以全球变暖为主导的气候变化（Asadieh et al.，2015；Shi et al.，2015）。全球变暖的主要诱因之一是大气温室气体浓度升高，特别是进入工业化时代（约 1750年）以来，由于科学技术的跨步式发展，人类对自然的干扰能力逐渐增强，如化石燃料的大规模开采使用、森林植被破坏、高强度的化肥施用以及如氟利昂等合成物的大规模使用等，导致二氧化碳、甲烷、氧化亚氮等温室气体的不平衡排放，是造成全球变暖的重要原因。CH4是仅次于CO2的重要温室气体，对全球温室效应的贡献约达18%（IPCC，2007）。

土壤甲烷氧化在调节大气CH4浓度、区域生态系统碳氮过程中具有重要地位（IPCC，2001）。即使在长期渍水的稻田土壤，其产生的CH4也有大部分被土壤 CH4氧化菌所氧化（张晓艳等，2016）。但由于土壤CH4氧化微生物较敏感，土壤甲烷氧化能力受到如土壤透气性、有机质含量、氮素、降水、温度、pH以及管理方式等诸多因素的影响（邓湘雯等，2012；张丹丹等，2017）。其中，植被类型可以通过多种途径影响土壤性质，不同植被类型土壤在有机质含量、养分和活性成分等方面都存在一定差异。这些差异都密切关系到土壤甲烷氧化菌种群结构和活力（Conrad，2007；李超男等，2017）。重要的是，陆地生态系统正是由不同植被复合而成。因此，明确不同植被类型土壤甲烷氧化能力，对准确估算温室气体排放具有重要意义。针对此，国内外已开展了大量研究，并进一步探讨了诸如pH、氮浓度和形态、温度等众多因素对其所产生的影响（Ishizuka et al.，2000；Strieg et al.，1992；刘惠等，2008；刘实等，2010）。

然而，目前对土壤 CH4氧化及其影响因素的认识还不充分，有些现象和结论存在一定争议，例如关于铵态氮和硝态氮对土壤甲烷氧化所产生的作用是刺激或是抑制仍有争论（Adamsen et al.，1993；程淑兰等，2012，王智平等，2003）。同时，这些研究大多基于通量观测进行的，关于土壤甲烷氧化同位素分馏的报道尚不多见（Tyler et al.，1994；Zhang et al.，2015；张晓艳等，2016）。但是，了解土壤甲烷氧化碳同位素分馏特征，对认识土壤甲烷氧化机理具有重要意义。因此，本文以滇中飒马场小流域以及附近化佛山自然保护区为研究对象，选取了 6种典型植被类型土壤，基于室内好氧培养试验研究了不同土壤甲烷氧化速率、碳同位素分馏特性及其与土壤性质的关系，以期为调控土壤甲烷氧化、温室气体减排提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

样地位于滇中高原楚雄州牟定县凤屯乡飒马场小流域（101°28′E，25°24′N）及附近化佛山自然保护区。当地属北亚热带湿润季风气候，年平均气温15.7 ℃，年降雨量800～1300 mm，干湿季分明，降雨主要集中在5—10月（约80%）。当地土壤主要为由紫红色页岩发育而成的紫色沙土。飒马场小流域的原生植被于上世纪50年代遭到毁坏，之后在“飞播造林”和“退耕还林”等措施下陆续形成了如今的多种次生性或人工性植被。基于勘察，于飒马场小流域选取了针叶林、针阔混交林、常绿阔叶林、草地及稻田5种植被类型，并于化佛山自然保护区内选取1种典型植被（常绿阔叶林，文中记为原始林）进行研究。不同植被类型（稻田除外）主要物种如表1所示（张国盛等，2011；张颖等，2012）。所有土壤样品均采集于2012年6月。每块样地采集3个表层（0～20 cm）重复样品，并立即带回实验室处理，备用。

1.2 好氧培养试验方法

取50 g土样于三角瓶中，分别加入去离子水调节土壤含水量至85% WHC（土壤持水量），密封瓶口。加入高纯CH4至浓度为10000 μL·L-1，并放入培养箱黑暗条件下预培养1周。预培养结束后打开瓶塞，与外界通气一晚后再次密封，注入高纯CH4至浓度为10000 μL·L-1，放入恒温培养箱暗培养30 min后测定瓶内CH4浓度和δ13CH4，分别记为初始CH4浓度和初始δ13C浓度。之后每隔一定时间取样测定CH4浓度和δ13CH4，取样间隔时间取决于CH4浓度下降情况。其中CH4浓度分析一般为1天1～2次，而δ13CH4则在试验开始和CH4浓度降至约为初始浓度的3/4、1/2和1/4时取样测定。

1.3 土壤理化性质分析

本文所测定的土壤理化性质指标包括 NH4+-N（铵态氮）、NO3--N（硝态氮）、可溶性有机碳（DOC）、pH、有机碳、全氮、活性铁、活性铝、活性锰和土壤持水量（WHC）。其中，土壤NH4+-N和NO3--N首先用2 mol·L-1KCl溶液（土水比为1∶5）在250 r·min-1下振荡提取 1 h，过滤后用连续流动分析仪（Skalar，Holland）测定；土壤可溶性有机碳（DOC）首先配置土水比（V/m）为1∶5的悬浊液（10 g干土样），常温振荡浸提30 min并高速离心20 min（8000 r·min-1），过滤后（0.45 μm）用总有机碳分析仪（Multi N/C 3000）测定；土壤pH则先用去离子水配置水土为2.5∶1（V/m）土壤悬浊液，用pH计（pHs-3C）测定；土壤有机碳和全氮采用 N/CN元素分析仪（Vario Max CN）测定；土壤活性铁、活性铝、活性锰先用草酸-草酸铵缓冲溶液（pH=3.2）提取，提取液用电感耦合等离子体发射光谱仪（Optima 8000）测定；把通过 20目筛的土样置于用棉球塞住的漏斗中，加去离子水浸泡 2 h，加盖，除去棉塞放置过夜后测定土壤持水量（WHC）。

1.4 数据分析

CH4氧化速率（Ψox）由以下公式计算：

式中，Ψox为 CH4氧化速率，μg·g-1·d-1；dc/dt为培养瓶内气相 CH4浓度单位时间的变化，μL·L-1·d-1；VH为培养瓶内上部空间的体积，L；ms为干土质量，g；Mm为CH4的摩尔质量，g；MV为标准状态下摩尔体积，L；T为培养温度，K。

表1 不同植被类型主要植物物种Table 1 The dominant species at the five sample sites

碳同位素分馏系数 αox采用以下公式计算（Coleman et al.，1981）：

式中，δCt=0是开始培养时CH4的δ13C的浓度；δCt是培养一定时间t后剩余CH4的δ13C的浓度；f是培养时间t时剩余CH4占外加总CH4量的比值。基于数据，本文计算了甲烷浓度降低至初始浓度的3/4、1/2和1/4时的Ψox和αox，以供分析。

本文的数据分析，包括相关分析、回归分析、方差分析及标准偏差等均在统计软件SPSS 15.0 for Windows（SPSS Inc.，Chicago）和 Microsoft Excel 2016中完成。

2 结果和讨论

2.1 土壤基本理化性质

由表2可知，6种植被类型土壤均呈酸性且其pH极为接近（变异系数仅为3.2%）；同时，土壤活性铝含量差异也相对较小，变异系数为13.4%；而TC（全碳）、TN（全氮）、NO3--N（硝态氮）、NH4+-N（铵态氮）、DOC（可溶性有机碳）、活性铁和活性锰差异比较明显，均在中等变异以上（C.V.>50%），特别是 NO3--N，达到强度变异（131.9%）。另外，稻田土壤NO3--N含量最高，应为人工施用氮肥所致；其余指标（除pH外）基本呈现原始林>稻田>针叶林>混交林>阔叶林>草地的规律（表2）。

2.2 土壤CH4氧化速率及碳同位素分馏特征

不同时段（甲烷浓度分别降低至初始浓度的3/4、1/2和1/4时），土壤CH4氧化速率Ψox和碳同位素分馏系数αox如图1所示。据核算，原始林、针叶林、混交林、阔叶林和草地土壤的平均Ψox分别为 3.83、4.39、1.78、3.21 和 0.95 μg·g-1·d-1，均显著低于稻田土壤的 10.75 μg·g-1·d-1（图 1a）。该结果与已有研究互有异同，相似的如Tilman et al.（2001）也发现Ψox大小顺序为森林土壤>耕地土壤>草原土壤；不同的如Ishizuka et al.（2000）、Menyailo et al.（2003）所发现的阔叶林土壤Ψox高于松林土壤（本文为针叶林土壤>阔叶林土壤）。这可能与植被年限、土壤质地、水热条件的不同以及由此引起的土壤性质和微生物差异有关。同时，原始林、针叶林、混交林、阔叶林、草地和稻田土壤的平均 αox分别为1.017、1.013、1.012、1.015、1.012和1.022，与其他研究结果十分接近（Coleman et al.，1981；Reeburgh et al.，1997；Snover et al.，2000）。

表2 土壤样品基本理化性质Table 2 The main properties for the soil samples

图1 不同土壤的CH4氧化氧化潜力(a)以及碳同位素分馏系数αox（b）Fig. 1 CH4 oxidation potential (a) and the carbon isotope fractionation factor αox (b)

详细来看，不同时段内（甲烷浓度分别降低至初始浓度的 3/4、1/2和 1/4时），αox和 Ψox各有不同（图1）。原始林、针叶林、混交林、阔叶林和草地Ψox随培养时间的延长呈上升趋势，而稻田则依次下降（图 1a）。分析原因认为，本研究所设计的甲烷浓度，对 5种非稻田土壤来说基本属于“ 底物丰富”状态；在长期培养下，土壤氧化菌总体活力（包括数量和氧化能力）上升且受底物浓度的限制较小，因此 Ψox整体上升（图 1a）。而稻田土壤甲烷氧化菌长期暴露于高浓度甲烷环境，氧化菌总体活力均较高，在活化培养后氧化活力达到很高状态，因此前期 Ψox很高，后期 Ψox则在甲烷浓度降低的影响下逐渐下降（图1a）。

相应地，原始林、针叶林、混交林、阔叶林和草地土壤 αox呈先上升后下降趋势，而稻田土壤则呈下降趋势（图1b）。同时，不同土壤αox和Ψox呈高度正相关，在 CH4浓度分别降低至初始浓度的3/4、1/2和 1/4时，两者的相关系数分别为 0.96（P=0.003）、0.60（P=0.207）和 0.75（P=0.089），平均为0.92（P=0.010）。这与很多研究结果不同（张晓艳等，2016）。一般而言，Ψox越高，CH4氧化菌对底物（12CH4和13CH4）的选择性则越低（αox下降）。如Templeton et al.（2006）指出细胞数量较低时，αox大于1.030，而细胞数量较高时，αox为1.003。同理，培养温度升高导致 αox下降的现象也能在一定程度上说明 Ψox与 αox之间的负相关关系（Borjesson et al.，2001；Tyler et al.，1994）。但是，植被类型会对土壤微生物种类和数量产生重要影响（Breulmann et al.，2012；Jangid et al.，2011；Tilman et al.，2001）。在不同植被类型土壤中，CH4氧化菌的种类、活性和亲和性可能都存在差别（李超男等，2017；邓湘雯等，2012）。研究显示，处于高CH4浓度环境中的CH4氧化菌以及处于低浓度下的 CH4氧化菌分别表现为高亲和力（Bender et al.，1992）和低亲和力特征（Topp et al.，1997）。据此，本研究稻田土壤属于低亲和类，而其余5种土壤则属于高亲和类。高亲和力、低活力的甲烷氧化菌对底物的选择可能相对较弱，而低亲和力、高活力类型氧化菌则对底物选择相对较强。由此来看，在培养前期，稻田土壤甲烷氧化菌活力高但对甲烷亲和力低，因此氧化菌对底物选择性相对较高，从而表现出较高的 αox；在后期，由于受到底物供给的限制，对底物的选择性降低，因此表现出较低的 αox。与稻田土壤不同的是，其余 5种土壤虽然甲烷氧化菌亲和力高，但前期活力很弱（图1），对底物选择性也总体较弱；随着其活力的增强，对底物选择性逐渐升高；但在后期，其对底物的选择也受到底物浓度限制。因此，其 αox表现出先上升后下降的规律（图1b）。同时，这也是6种土壤αox和Ψox呈正相关关系的主要原因，但其中机制仍需进一步深入研究。

2.3 土壤CH4氧化速率及αox值影响因素分析

不同时段（甲烷浓度分别降低至初始浓度的3/4、1/2和1/4时），土壤 Ψox和 αox与土壤性质的关系如表3所示。可见，Ψox与pH呈负相关（r=-0.51，P=0.298），与活性铝、活性铁、活性锰相关性有正有负且基本未达显著水平，而与 TC（r=0.46，P=0.356）、TN（r=0.74，P=0.093）、NO3--N（r=0.93，P=0.006）、DOC（r=0.96，P=0.002）等呈正相关（表3）。同时，除数值上的差异外，不同时段的相关系数的正负性基本一致（表3），说明Ψox与各影响因素之间的关系是稳定的。土壤Ψox与pH呈负相关主要是因为大多甲烷氧化菌的最适生长 pH范围为6.6～6.8，而进行甲烷氧化活动的适宜pH范围也大约为 7.0（Bender et al.，1995；Hanson et al.，1996）。较低pH将对甲烷氧化菌活性产生一定抑制作用。土壤Ψox与TC、TN、DOC等呈正相关，主要因为这些物质存在于土壤有机质中，而土壤有机质含量越高，可能越有利于甲烷氧化菌生存。同时，Ψox与NO3--N和NH4+-N的正相关性，说明氮素对土壤甲烷氧化有促进作用，但这与很多研究不相一致（张晓艳等，2016；Adamsen et al.，1993），如张晓艳等（2016）指出稻田土壤 Ψox与 NO3--N和 NH4+-N呈负相关。但是，NO3-和NH4+对土壤CH4氧化作用的影响，也与甲烷氧化菌类型、氮素种类和数量以及土壤状况有关（王智平等，2003）。在不同土壤中，氮素的高低或输入对土壤甲烷氧化的作用可能表现为抑制，也可能表现为促进，也可能无明显影响（Hutsch et al.，1996；Hutsch et al.，1994；Nesbit et al.，1992；程淑兰等，2012；Christensen et al.，1997）。因此，本研究所观测到的氮素对甲烷氧化的促进作用是可能的，且可能与土壤碳积累有关（Borjesson et al.，1998）。另外，αox与土壤性质的相关性与 Ψox基本一致（表3）。可以推测，其主要原因是土壤αox与Ψox存在高度正相关性（r=0.92，P=0.010）。

表3 不同时段土壤CH4氧化速率以及氧化同位素分馏系数与土壤基本性质的关系Table 3 Relationship between CH4 oxidation potential, carbon isotope fractionation factor and soil properties in different periods

3 结论

基于室内好氧培养试验，研究了滇中高原6种典型植被类型土壤CH4氧化速率Ψox和碳同位素分馏特征及其影响因素。结果表明，不同土壤Ψox有较大差异，稻田、原始林、针叶林、混交林、阔叶林和草地土壤的平均Ψox分别为10.75、3.83、4.39、1.78、3.21 和 0.95 μg·g-1·d-1。相关分析表明，Ψox与活性铝、活性铁和活性锰呈弱相关，与pH呈负相关（r=-0.51，P=0.298），而与TC（总碳，r=0.46，P=0.356）、TN（总氮，r=0.74，P=0.093）、NO3--N（硝态氮，r=0.93，P=0.006）、DOC（可溶性有机碳，r=0.96，P=0.002）呈正相关，特别是 NO3-和DOC，相关性达到显著水平（P=0.006和P=0.002）。说明在这种土壤条件下，pH对甲烷氧化具有抑制作用，而土壤有机质和氮素则有促进作用。同时，稻田、原始林、针叶林、混交林、阔叶林和草地土壤同位素分馏系数αox分别为1.022、1.017、1.013、1.012、1.015和 1.012。土壤 αox与 Ψox呈高度正相关（r=0.92，P=0.010），可能与不同土壤中甲烷氧化菌的甲烷亲和力和总体活力有关。

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