荧光法测石榴中维生素C

王军锋，李思佳，王晓兰

(陕西学前师范学院 化学与化工系，陕西 西安 710100)

石榴，营养丰富，其籽粒味道甘美，且石榴含有丰富的维生素C。维生素C，又称L-抗坏血酸，是人体必需营养素之一，缺乏维生素C会致使坏血病，因此，必须从食物中获取。目前测量维生素C的方法主要有高效液相色谱法[1]；紫外分光光度法；碘量法；荧光法[2]；电化学法[3]，滴定法、酶法；以及2、4-二硝基苯肼法等，除此之外Deutsch和Weeks曾经报道过一种检测维生素C的荧光分析法(OPDA)，并被指定为维生素C的经典荧光分析法[4]。在该方法中，维生素C先被活性炭(Norit)氧化为脱氢抗坏血酸(DHAA)，DHAA再与荧光底物邻苯二胺(OPDA)结合生成荧光产物，通过对该荧光产物的检测实现对维生素C的定量分析[5]。本文基于维生素C在草酸作溶剂不外加增敏剂的条件下经Cu2+氧化后与邻苯二胺反应生成一种较强的荧光物质，通过对体系荧光强度的测定进行维生素C的定量分析，其荧光强度与维生素C的浓度成正比，该方法所涉及的体系稳定性好，据此优化了荧光测定维生素C的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

日立F-7000荧光分光光度计；上海F-960荧光分光光度计；PHS -3C精密pH计，上海雷磁仪器厂； 水浴锅。

1.1.2 试剂

抗坏血酸(分析纯)；1%草酸溶液；CuSO4溶液：0.04mg/mL；维生素C标准储备液：1mg/mL，2～8℃避光保存；NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液；HAc-NaAc缓冲溶液；NaOH-KHPO4缓冲溶液；KH2PO4- Na2HPO4缓冲溶液；500g/L乙酸钠溶液；0.2g/L邻苯二胺溶液(临用前配制)；30g/L硼酸-500g/L乙酸钠溶液(临用前配制)；偏磷酸-乙酸溶液；试验用水为蒸馏水。

1.2 原理

维生素C自身没有荧光，样品中还原性抗坏血酸(维生素C)在草酸溶液后溶解后经氧化剂(Cu2+)氧化为脱氢抗坏血酸(DHAA)，再与邻苯二胺(OPDA)反应产生具有荧光的喹喔啉，其荧光强度与维生素C的浓度在一定范围内呈线性关系。因果蔬中丙酮酸也可与邻苯二胺反应生成荧光化合物，加入硼酸后脱氢抗坏血酸与硼酸可构成络合物而不能跟邻苯二胺反应，而丙酮酸依然可以和邻苯二胺反应，所以用加入硼酸后测出的荧光强度为空白对照，以此除清样品中杂质所造成的干扰。

1.3 实验方法及过程

在25mL容量瓶中依次加入1mL的维生素C标准溶，4mL CuSO4溶液，4mL缓冲溶液，氧化五分钟后加入3mL邻苯二胺溶液用蒸馏水定容，摇匀。在25℃恒温水浴中加热30min，将溶液冷却至室温后，在激发波长为355nm，在发射波长425nm处，测定其荧光强度F，以不含维生素C的试剂为对照组，标准系列荧光强度分别减去标准对照荧光强度为纵坐标，所对应的抗坏血酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。记录直线回归方程。

2 结果与讨论

2.1 试剂加入顺序

按照试验方式，在试剂加入量无差别的情况下，查验试剂的不同加入顺序，测定其荧光强度，按照加入试剂的排列顺序不同，选择荧光强度最好最不变的一项为最佳加入试剂顺序。测得当λn=415，Y=2,sens=2各试剂用量均为1mL，在25mL容量瓶中依次加入维生素C标准溶，CuSO4溶液，NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液，邻苯二胺溶液时体系的荧光强度最大。

2.2 氧化剂浓度及用量的选择

维生素C极易被氧化，因此，氧化剂Cu2+浓度对实验的影响很大。图1中为Cu2+浓度为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.20mg/mL范围内转变时对系统荧光强度的影响，由图知当Cu2+浓度小于0.04时体系的荧光强度呈上升趋势，说明仍在继续氧化，而在Cu2+浓度大于0.04时，体系的荧光强度呈降落去向，Cu2+浓度为0.04时系统的荧光强度最大，是以选定该浓度为最好氧化剂浓度。

图1 氧化剂浓度对体系荧光强度的影响

2.3 pH值与缓冲溶液的影响

缓冲溶液不同对系统的荧光强度影响有显著差异，实验如下pH值=6.0的缓冲溶液：NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液、HAc - NaAc缓冲溶、NaOH - KHPO4缓冲溶液、KH2PO4- Na2HPO4缓冲溶液，在其他试剂加入量无差别的情况下，各加入1mL上述缓冲溶液，结果表明缓冲溶液选择NaOH-邻苯二甲酸氢钾时该系统的荧光强度最大。

溶液的pH值对系统的荧光强度影响很大，配制pH值=5.0～6.0的NaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液，当pH值=5.6且用量为4mL时荧光强度到达最大值且比较稳定。

2.4 加热温度和加热时间对荧光强度的影响

室温下一般的氧化反应大多数是慢反应，而温度对体系荧光强度也有较大影响，在他试剂加入量相同的条件下，设置不同的加热温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)测定荧光强度，再设置不同的加热时间(10min、20min、30min、40min、50min)测定荧光强度，根据实验所得数据选择最佳加热温度和加热时间。当水浴温度为25℃时恒温30min时系统的荧光强度呈现最大值。

2.5 氧化时间对荧光强度的影响

实验中测定了不同氧化时间和不同反应时间下的荧光值，结果显示，当t≥10min时，氧化剂氧化基本完成而且趋于稳定，因此选定氧化时间为10min进行氧化。将体系放置不同的时间进行梯度实验，在相同的实验条件下，每隔10min测量一次，做10组，分别测量其荧光强度，结论：体系荧光强度在20min左右可达到最大值，为了使反应彻底完全，因此选定放置时间为25min。

2.6 邻苯二胺浓度对荧光强度的影响

邻苯二胺的浓度是实验中的重要条件，在其他前提条件稳定的情况下，对邻苯二胺的浓度设置梯度(采用0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30g/L)，在此条件下逐个测定系统荧光强度，由图2可知，当邻苯二胺浓度>0.15g/L时，系统的荧光强度趋于稳定，为了使DHAA彻底反应，选择0.2g/L为最好邻苯二胺浓度。

图2 邻苯二胺浓度对体系荧光强度的影响

2.7 稳定性实验

在放置时间为20min左右时测定其稳定值，每隔10min一次，测20组，得出结论：系统荧光强度可不变10min，见图3。

图3 反应时间对体系荧光强度的影响

2.8 激发和发射波长的选择

对维生素C 标准溶液和空白试剂溶液按上述方法反应后的荧光物,分别在290～330nm，350～500nm内扫描得到激发和发射光谱，如图4所示，由图4中可以看出。在激发波长为355nm，发射波长为426nm时，系统处于最好荧光强度，空白试剂的荧光值比较稳定，则选择激发波长为355nm，发射波长为426nm。

图4 激发波长和发射波长

2.9 标准曲线的绘制

图5为抗坏血酸浓度和其相对荧光强度之间的曲线图。

图5 工作曲线

从图5中可以看出维生素C在浓度为0.002～4μg/mL的范围内与系统的相对荧光强度值Δ F呈现杰出的线性关系，线性回归方程为y=74.481x+8.5215，R2=0.9902。

2.10 测定样品

将石榴样品按上述方式测定后，测定荧光强度F，同时测定样品空白溶液荧光强度F0,并得出实际的荧光强度ΔF=F-F0。根据维生素C 的标准曲线，得出石榴中维生素C 的含量。

3 结论

本文实验了荧光法测定石榴中维生素C的含量的检测方法，维生素C在0.002～4μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，检测限较低，采用荧光法测定石榴中维生素C含量，具有简便，快速，灵敏度高，结果准确等优点，可以满足实际测量的需要。

测量样品结果显示同一颗石榴，背阴面与朝阳面向比，其荧光强度有所减弱，即朝阳面所测荧光强度较强，所以，石榴的朝阳面果实其维生素含量高。

由于所取石榴均为陕西省西安市临潼区所产，分别取三地样品(斜口、胡王、秦陵)，实验所得样品荧光强度并无太大性差异，因此，此三地的石榴维生素含量均比较丰富，可以满足人体对维生素的需求。

[1] 李圣男，蔡大川，郑家概，等.HPLC法测定番石榴中总维生素C的含量[J].广州化工， 2017,45(11):136-138.

[2] 崔 香，寇雪玲.荧光分析法测定枸杞中维生素C[J].青海师范大学学报，2009(2):58-60.

[3] 彭文峰,Seddon B J,张学记,等.平行双铂丝微电极用于铁氰化钾电流滴定法测定抗坏血酸的研究[J].分析化学,1992,20(7):837-839.

[4] Li Xiaoyan,Zhang Yuanqin,Wang Le.A new highly sensitive spectrofluorim etric method for the determ ination of ascorbic acid[J].Journal of sichuan university (Natural Science Edition),2003,40(3):546-547.

[5] 孙振艳,赵中一,郭小慧,等.荧光分析法测定维生素C[J].化学分析计量，2006,15(4):18-20.