实时荧光核酸恒温扩增技术和尿液快速检测法对孕前优生健康检查人群中淋球菌检测的应用比较△

张宏萍 包 杰

(河南省光山县计划生育服务站 光山 465450)

淋病主要通过性接触传播，由淋病奈瑟菌(NG) 引起的泌尿生殖道化脓性感染，对人体生殖系统的健康危害极大，孕龄女性一旦感染，容易引起输卵管堵塞、不孕、宫颈炎、流产、新生儿脓漏眼病等，孕前及时进行检测、诊断和治疗，是实现优生优育、保证新生儿健康的重要手段[1]。

不典型症状淋病患者主要依靠实验室检查帮助诊断，目前实验室常用的方法有直接涂片、分离培养、免疫荧光等，由于分析时间长短不一，检出率高低不等，其存在的假阳性和假阴性是困惑各实验室的普遍现象，且常用淋球菌检测的都是患者的泌尿生殖道分泌物标本，容易增加患者的痛苦、降低检测的依从性，因此，寻找准确、快速、实用的检测方法有着重要的意义[2]。笔者联合河南省人口和计划生育科研院对孕前优生健康检查人群，以尿液作为样本同时应用快速检测法和 SAT技术进行NG的检测，对这两种方法的特异性、敏感性等指标来综合分析，以期为实验室选择正确的检测方法，为临床提供可靠的诊断依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本来源

选择2017年1～6月来本站进行孕前优生健康检查人群中有尿道口红肿、脓性分泌物明显、尿急尿频尿痛等症状的疑似病例100例，无症状100例，年龄20～35岁。 要求所有人员在标本采集的前7～10d禁止采用抗生素药物。

1.2 样本采集

每个检查对象取1份尿道(阴道) 分泌物拭子和2份尿液标本。

1.2.1拭子标本采集

用特制无菌棉拭子伸入女性宫颈口或男性尿道口1～2cm ，轻轻旋转并停留10s后取出，立即保温送检。

1.2.2尿液标本采集

1份初段尿标本用于淋球菌快速检测； 另1份初段尿1mL与1mL尿液保存液(SAT试剂盒提供)混合置于EP 管中-20℃冷冻储存，用于SAT检测。

1.3 试剂与方法

1.3.1试剂

尿液淋球菌快速检测试剂盒由郑州安图绿科生物提供；SAT法恒温扩增检测试剂盒(NG-RNA)由上海仁度生物提供，TL 988 PCR仪由西安天隆科技提供；另购进郑州人福博赛生物生产的巧克力培养基做分泌物分离培养对照用。

1.3.2方法

(1)尿液淋球菌快速检测按照试剂盒的说明进行操作，要求1h内完成。取2mL初段尿加入反应试管内，垂直滴加3滴试剂，塞紧管塞轻轻摇匀， 放置5min后再轻轻摇匀1次，观察反应管内尿液上部形成气泡情况。

文学作品还应该注意体裁和题材的区分。题材指文学艺术作品的材料内容，如描写历史、军旅等题材。文学作品应首先按其体裁而不是按其内容题材归类。如果是以文学的形式来传播科学知识的作品，虽然有文学价值，但也应该依其内容归类而不应归入文学类。但如果是以文学体裁形式著述的，并带有科学性质的儿童读物、科学故事等，可以按文学体裁形式进行分类。

(2)SAT预留标本适时集中冷冻送往协作单位检测，检测按照试剂盒说明书操作，设置阴、阳性对照。

(3)分离培养法取分泌物立即接种于巧克力琼脂培养基,置5%CO2环境中37℃培养24～48h，根据菌落形态进行鉴定，取典型菌落涂片染色镜检为革兰阴性双球菌者为阳性。

1.4 统计学分析

尿液淋球菌快速法和SAT 法检测结果采用SPSS13.0统计学软件中的配对χ2检验进行统计学分析，结果以率表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结果判断

(1)尿液淋球菌快速法是利用淋球菌侵入尿道上皮细胞,产生细菌生化酶, 加入试剂与含有此酶的尿液产生生化反应， 若液面上部形成一层气泡或液面上层管壁形成一圈细小的气泡者判读为阳性，20min后结果无效。

(2)SAT法检测结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阴、阳性对照对检验结果进行判定。dt ≤35的样本为阳性；dt为40或无数值的样本为阴性。

(3)以淋球菌培养法为金标准，计算SAT检测尿液样本及拭子样本的灵敏度及特异性。

2.2 尿液淋球菌快速法和SAT检测结果比较

200例受检者中尿液淋球菌快速法阳性率为28%，NG-SAT法阳性率为22%，其中100例疑似标本尿液快速法与SAT法阳性率分别为44%、39%，100例无症状标本尿液快速法与SAT阳性率分别为12%、5%，尿液快速法阳性率均高于SAT法(P<0.01)。

表1 2种方法检测淋球菌与分离培养法阳性率对照统计表[n(%)]

标本类型(n)分离培养法尿液淋球菌快速法NG-SAT 法阳性阴性阳性率(%)阳性阴性阳性率(%)阳性阴性阳性率(%)疑似标本100376337445644396139无症状标本10039731288125955合计200401602056144284415622

200例受检者中，SAT法与分离培养法检测NG时有8例结果不一致，其中5例培养阴性SAT阳性，3例培养阳性而SAT阴性；尿液快速法与分离培养法检测NG时有16例结果不一致，其中10例培养阴性快速法阳性，6例培养阳性而尿液快速法阴性。世界卫生组织推荐培养法为用于诊断 NG感染的 “金标准”，通过感染者真阴性、真阳性的比较得出尿液快速法的敏感性和特异性分别为100%、90%，SAT法的敏感性和特异性分别为100%、97.5%，SAT法的特异性高于尿液快速法7.5%，两者差异有统计学意义(P<0.05)。

两种方法的敏感性和特异性，见表2。

表2 两种方法检测淋球菌的结果比较

方法阳性阴性真阳真阴敏感性特异性尿液淋球菌快速法5614440160100%90.0%NG-SAT4415640160100%97.5%

3 讨论

淋病是目前发病率较高的性传播疾病(STD) 之一，无症状淋病患者是传播淋病奈瑟菌感染的重要原因， 广泛开展性病的早期筛查、早期诊断以及早期治疗极为重要。 传统的NG检测方法存在检出率低、周期较长、特异性差等缺点，给诊断和治疗带来困难，建立高敏感、高特异、快速便捷的实验室诊断方法对临床诊断和治疗有重要意义[3]。 本研究采用尿液快速检测法和SAT技术对孕前优生健康检查对象的尿液样本进行NG检测，以找到适合基层实验室的方法学，并为其治疗提供合理的依据。

尿液淋球菌快速检测法是基层常用的方法之一, 其气泡的产生与淋球菌数量的多少有关, 隐性感染者泡沫产生速度相对较慢， 此项试验检测方法取材方便、操作简单、经济方便、患者容易接受，也便于快速诊断。但快速法敏感性强，易造成假阳性结果，实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)现已被广泛应用到病原体检测领域，该技术具有高灵敏性、高特异性、低污染、反应稳定等优点[4]，将实时荧光检测和核酸恒温扩增相结合，特异性提取尿液或拭子样本中的病原体RNA，交叉污染少，降低了假阳性、假阴性问题，有助于临床疗效监测。 有研究表明，NG-SAT在尿液和拭子检测中的结果无差异，标本符合率高达98.5%，首段尿标本与拭子的敏感性相当[5]，做非侵入性的尿液样本检测更易于采集接受，避免拭子取样的尴尬和痛苦，提高了患者取样的依从性，简化了收集流程，具有较大的临床应用价值。结果显示，SAT法与国内文献报道的NG阳性率更相近 ，该方法检测的假阳性率明显低于快速法，100例无症状者的阳性率并不是很高，但仍有一定的隐性感染情况，不容忽视。两种方法与培养法的符合率均高于90%，其中快速检测法的阳性率最高，正常情况下分泌物或尿中的杂菌的酶活性很低不致产生阳性反应，但当杂菌数量大大增加时可引起假阳性反应，同时严重蛋白尿和血尿也可影响结果，特别是女性分泌物标本，增多时会干扰试验产生假阳性[6]。 研究中发现分离培养和SAT检测结果不一致情况，可能由于淋球菌培养标本收集量太少，运送过程保温不当致菌体死亡等原因引起培养法的假阴性；也可能是受检者正处于感染初期，样本病原体DNA量少而RNA量，以RNA为检测靶标的SAT技术能够检测到病原体的存在[7]。由于SAT检测的是病原体 RNA，RNA在环境中极易降解，SAT法假阴性的原因可能是尿液保存不当或过度稀释， 抑或尿液中存在较多的扩增抑制物如晶体和亚硝酸盐等均可引起[8]。本研究结果显示SAT法检测疑似淋球菌感染患者尿液标本具有较高的灵敏度和特异度， 通过SAT法与尿液快速法检测NG的结果比较，应用SAT法可以帮助辨别快速法造成的假阳性,对临床症状不典型患者可以更好的检测出，避免了漏检，对于疑似病例的早期诊断具有重要临床意义。

综上所述，SAT技术既具备采样方便、耗时短、低污染的实验要求，又有敏感性高、特异性好、反应稳定、结果准确可靠等优点，还可用于用疗效观察和判愈评估，并为淋球菌的实验室诊断提供新的采样方式和检测方法，该技术更具有临床实用性，优于目前其他检测方法[9]。尿液淋球菌快速检测法具有操作简单、 试剂便宜、 结果易判断的优点,可作为基层单位大批量体检标本的初筛手段，针对可疑标本配合使用SAT技术可以互相弥补，以供临床综合诊断，提高淋球菌检测的准确率。

1 肖秀美,高爽,杨旭,等.2998例男性患者解脲脲原体、淋病奈瑟菌和沙眼衣原体感染调查分析.中国男科学杂志,2016,30(1):21～24.

2 邓冲.分离培养法与涂片镜检法在诊断女性淋球菌感染的临床应用比较.国际检验医学杂志,2013,34(14):1853～1854.

3 周璐,蔡筠,谢建生.实时荧光核酸恒温扩增技术在不孕育龄妇女病原体检测中的应用研究.医药前沿,2013,3(21):55～56.

4 马萍,聂庆东,殷敏.3种方法检测淋病奈瑟菌的比较分析及意义.医学检验,2012,2(9):126～128.

5 钟春燕,章小花,裘新民,等.实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用评价. 中国卫生检验杂志,2015,25 (23):4041～4045.

6 张睿,叶阿里,孔令君,等.临床患者三种性传播疾病分子生物学检测分析.现代检验医学杂志,2015,30(3):107～110.

7 黄剑芳.三种检测淋病奈瑟菌方法的比较.医学检验,2011,18 (3):71～72.

8 郑雅萍,袁青,陈伟.实时核酸恒温扩增技术在奈瑟菌感染检测中的应用.浙江实用医学,2015,20(1):56～58.

9 高志华,金印,陈峰.实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中淋球菌的分析.国际检验医学杂志,2012,33(4):463～464.