DNA甲基化在肾癌中的研究进展

陈 翔 综述，郭剑明 审校

(复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海 200032)

肾癌是泌尿系统常见肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%～3%，以肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)最常见，其中约25%的患者在初诊时已有转移[1]。肾癌的发病原因尚不清楚，可能与基因改变有关。尽管局限性肾癌可通过手术根治，但30%的患者出现术后复发或转移[2]。肾癌对放化疗高度抵抗，目前对转移性肾癌仍缺乏根治手段，通常采用靶向药物治疗以延长生存期[3]。

表观遗传学主要研究影响基因表型但不涉及DNA序列改变的遗传调控机制，包括但不限于DNA、mRNA和组蛋白的各类共价修饰以及非编码RNA的转录调控作用。和遗传学改变类似，表观遗传改变在肿瘤的发生和进展中也起到重要作用，其中以DNA甲基化的研究最为深入。DNA甲基化是指在CpG双核苷酸的胞嘧啶环5位碳原子上连接甲基，是一种可遗传、可逆的共价修饰，主要由DNA甲基转移酶引发并维持。启动子和增强子区域的甲基化可导致基因转录活性降低，下调蛋白表达水平[4]。目前已有不少DNA甲基化与肿瘤发生、诊断、预后、耐药和治疗相关的报道，现对DNA甲基化在肾癌中的研究进展进行综述。

1 DNA甲基化与肾癌的发生和进展

肾癌的发生与多种基因的突变、激活和抑制有关；这些基因同时受遗传和表观遗传调控，两种调控机制在不同基因中的重要性不一。既往研究已发现，绝大部分家族性ccRCC和70%的散发性ccRCC病例中存在von Hippel-Lindau (VHL)基因失活和低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)累积，促进肾癌发生和血管生成[5]。VHL基因的失活可由基因突变或启动子甲基化造成，其中仅7%的VHL失活由启动子甲基化造成，且与基因突变互斥，说明表观遗传改变并非VHL失活的主要原因[6]。肾癌存在遗传异质性，在VHL/HIF通路外，也存在其他基因的启动子甲基化失活，这可能与VHL/HIF通路靶向药物耐药有关[7]。

RICKETTS等[8]发现40%的肾癌肿瘤组织中存在OVOL1基因启动子甲基化；该基因的产物可抑制转录因子c-Myc的表达，其甲基化则增加c-Myc表达，激活多种癌基因，促进肾癌的发生。抑制转化生长因子β( transforming growth factor β，TGFβ)信号通路的SMAD6基因也在肾癌中被发现存在高甲基化，可激活TGFβ通路并促进肿瘤增殖[9]。TEZVAL等[10]发现促肾上腺皮质激素释放结合蛋白基因(corticotropin releasing hormone-binding protein，CRHBP)甲基化可促进肾癌的转移，提示肾上腺轴激素在肾癌的进展中可能起到一定的作用。CHD5这一抑癌基因的表达产物可抑制肿瘤上皮间质转化及肿瘤干细胞的产生。肾癌中CHD5几乎不发生突变，但在44%的肾癌组织中因启动子甲基化而处于沉默状态，使肿瘤易于迁移和侵袭[11]。NELL1和NELL2蛋白分别与骨和神经发育相关。NAKAMURA等[12]发现肾癌细胞系和组织中这两个基因存在启动子甲基化，蛋白表达低于正常肾组织；而去甲基化药物处理可增加其表达，增加癌细胞的粘附性，抑制其迁移，这提示NELL1/2甲基化可能在肾癌的进展中发挥作用。

含胱天蛋白酶募集域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)能够诱发细胞凋亡；该基因在肾癌组织和细胞系中因启动子甲基化而低表达，且甲基化水平与Fuhrman分级相关。去甲基化药物可在体外实验中增加其表达，抑制肾癌细胞生长和侵袭，促进其凋亡，并激活抑癌基因p53；敲除该基因则促进癌细胞生长，减少凋亡，说明其甲基化可促进肾癌的进展[13]。骨形态生成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)与细胞分化、增殖和凋亡相关。在肾癌细胞系和组织中，BMP2基因启动子处于甲基化状态，上调BMP2的表达，可抑制肾癌细胞侵袭和迁移，并增加其凋亡，因此推测其与肾癌的发生有关[14]。

由上可知，在肾癌中，高甲基化所致的基因沉默影响各种抑癌基因表达，使肿瘤易于增大和进展。不同的抑癌基因中，甲基化和基因突变所起到的抑制表达作用不同。此外，从整体角度看，基因组的甲基化也与肾癌相关：大样本的病例对照研究发现基因组的整体低甲基化水平可增加肾癌发病风险，该结论和其它肿瘤组织中的研究结果相符[15]。其原因可能是低甲基化使基因组的稳定性降低，易于发生重组、突变、转座子重激活和癌基因激活，促进正常细胞向肿瘤细胞的转化。

2 DNA甲基化与肾癌的诊断

肾癌的临床诊断依赖于影像学初诊和病理学确诊，目前尚无特异性肿瘤标志物可进行早期诊断和筛查，因此近年来对特定DNA序列甲基化在肾癌诊断中的应用进行了探索。

HAUSER等[16]对55份肾癌血清总游离DNA进行分析，发现患者血清中APC、GSTP1、p14、p16、RAR-B、RASSF1A、TIMP3和PTGS2基因甲基化水平均高于对照组。单个基因甲基化用于肾癌诊断敏感性太低，联合使用APC、PTGS2和GSTP1进行诊断增加了准确性(灵敏度62.9%，特异度87%)，但仍难以满足临床要求。DE MARTINO等[17]也发现ccRCC患者(尤其是转移或坏死性肾癌)和对照组间RASSF1A和VHL基因甲基化存在显著差异，可能有诊断意义，但未对进行诊断效能评估和验证。XIN等[18]对尿标本中转录因子(transcription factor，TCF)21基因(TCF21)进行了分析，认为其甲基化水平可区分肾癌患者，但在肿瘤组织中验证却发现和尿液结果不一致。总之，目前基于体液标本的基因甲基化检测尚不能实现对肾癌的诊断。

3 DNA甲基化与肾癌的预后

年龄、TNM分期、病理类型、Fuhrman分级等是经典的肾癌生存预测因素，但随着基础研究深入，发现肾癌具有异质性，不同的遗传改变及分子标记也影响预后。表观遗传修饰，尤其是DNA甲基化，也被单独或联合经典因素用于预测肾癌生存期。

Ras-GTP酶激活蛋白DAB2IP编码基因在肾癌中常处于表观沉默状态，其沉默使HIF累积，促进肿瘤细胞增殖及上皮-间质转化，并导致靶向药物耐药[19]。进一步的研究发现DAB2IP基因转录起点上游的CpG1甲基化导致了其表达降低，并在多个队列中验证了DAB2IP CpG1甲基化是ccRCC患者总生存期的独立预测因素[20]。RASSF1(Ras相关家族成员)基因可编码RASSF1A和RASSF1C蛋白参与细胞内信号传递。KLACZ等[21]的研究发现RASSF1A的蛋白表达水平及启动子甲基化水平与肾癌患者总生存期相关，该蛋白可能有抑制肿瘤的作用；而RASSF1C则与肾癌进展和预后无关。UQCRH基因编码一种线粒体铰链蛋白，被认为是抑癌基因，在36%的ccRCC标本中呈现高甲基化，且其甲基化频率与肿瘤分期和分级相关[6]，在蛋白水平已证明其与早期肾癌的复发和死亡存在关联[22]。MCT4蛋白由SLC16A3基因编码，可跨膜转运乳酸，维持糖酵解和胞内pH平衡，对以糖酵解为主要能量来源的肿瘤细胞十分重要。FISEL等[23]发现MCT4蛋白在肾癌组织中表达增加，与生存时间呈负相关；SLC16A3基因启动子甲基化则与生存时间呈正相关，说明SLC16A基因的甲基化及MCT4蛋白表达可判断肾癌患者的预后。

肾癌的异质性使单基因甲基化预测肾癌结局存在局限，故进行了多因素预测模型研究。VAN VLODROP等[24]筛选出了GREM1、NEURL、LAD1和NEFH四种与肾发育和血管生成、Notch信号通路调控、细胞膜稳定和细胞骨架合成相关的基因，根据启动子甲基化基因的数目，建立ccRCC生存预测模型，具有较好的重复性。WEI等[25]通过检测肾癌组织中与FOXE3、PITX1、RIN1、TWF2和EHBP1L1基因相关的CpG甲基化位点建立了预测模型，在多队列验证中发现其具有较高准确性，且受肿瘤内异质性影响较小。半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenas 1，CDO1)与细胞抗氧化能力相关，并通过合成牛磺酸间接参与肾血流调控，在38.3%肾癌肿瘤组织中存在该基因启动子的甲基化。DECKERS等[26]在基于经典预测因素的模型中增加CDO1启动子甲基化这一变量，提高了新模型对肾癌生存预测的准确性。鉴于遗传背景的复杂性，现尚未建立预测准确且能广泛应用的模型，DNA甲基化用于肾癌生存预测仍处于初步研究中。

4 DNA甲基化与肾癌的耐药与治疗

Cx32蛋白可以抑制多药耐药基因1的表达，增强长春花碱对肿瘤细胞的毒性，但在肾癌细胞中Cx32基因启动子因高甲基化而沉默，进而产生耐药[27]。SATO等[27]发现，表没食子儿茶素没食子酸酯预处理肾癌细胞可恢复Cx32表达，降低肾癌的耐药性，但结论仍有待体内验证。肾癌对奥沙利铂的耐药主要是由于肿瘤中有机阳离子转运体2(organic cation transporters2，OCT2)表达较少，使药物难以进入细胞[28]。LIU等[28]发现，这一效应主要是由于OCT2基因启动子的高甲基化使转录因子无法结合造成的，而DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨可在体内和体外逆转肾癌对奥沙利铂的耐药。

高水平DNA甲基化除促进肾癌对化疗药物耐药外，也能逃避免疫系统对肾癌细胞的识别和杀伤。部分研究者对甲基化抑制剂单独或联合用于肾癌治疗进行了探索。CORAL等[29]使用毒性较小的甲基化抑制剂SGI-110在细胞水平对肾癌等肿瘤进行了研究，发现它能增强肿瘤抗原的表达，但未进行体内实验。AMATO等[30]则使用甲基化抑制剂MG98联合干扰素治疗肾癌患者，报道有一定的疗效，但该研究并非随机对照设计，还有待验证。现阶段研究已发现肾癌耐药与某些基因甲基化有关，甲基化抑制剂干预也有一定效果，但相应药物的安全性及有效性仍需进一步评估。

5 展 望

近年来随表观遗传学研究的深入，肾癌的表观遗传调控机制，尤其是DNA甲基化，已被逐渐阐明(见表1)，但尚未形成系统的理论。因正常细胞和肿瘤细胞本身存在较大的基因差异，基于血标本DNA甲基化诊断肾癌准确性较差。循环血肿瘤细胞分离提取技术使单独检测肿瘤细胞遗传特性成为可能，将有助于解决这一问题。肾癌的发生过程有多种因素参与，很难单独通过基因甲基化检测预测患者生存期，还需与经典临床因素进行整合，并在不同人群中进行验证。目前已发现一些与肾癌发生、进展及耐药相关的表观遗传靶点，但现有的甲基化抑制剂对作用基因无靶向选择性，其安全性存疑，难以用于临床。因此，甲基化抑制剂的靶向化，将成为相应药物研发的关键。

表1肾癌中甲基化沉默的基因及其功能

甲基化基因对肾癌影响VHL增加血管生成OVOL1,SMAD6,ASC,DAB2IP促进细胞增殖CHD5,NELL1/2,ASC,BMP2增强迁移和侵袭能力CRHBP促进转移DAB2IP,Cx32,OCT2诱导耐药

参考文献：

[1] 余霄腾，张崔建，李学松，等.索拉非尼治疗晚期肾癌患者的疗效及不良反应[J].现代泌尿外科杂志，2016,21(6):437-440.

[2] 向彬，种铁，雷光辉，et al.Smg-1在肾细胞癌中表达及其对预后的意义 [J].现代泌尿外科杂志，2016,21(11):853-856.

[3] LJUNGBERG B，BENSALAH K，CANFIELD S，et al.Eau guidelines on renal cell carcinoma：2014 update [J].Eur Urol，2015,67(5):913-924.

[4] SHENOY N，VALLUMSETLA N，ZOU Y，et al.Role of DNA methylation in renal cell carcinoma [J].J Hematol Oncol，2015,8：88.

[5] XING T，HE H.Epigenomics of clear cell renal cell carcinoma：Mechanisms and potential use in molecular pathology [J].Chin J Cancer Res，2016,28(1):80-91.

[6] NETWORK CGAR.Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma [J].Nature，2013,499(7456):43-49.

[7] MCRONALD FE，MORRIS MR，GENTLE D，et al.Cpg methylation profiling in vhl related and vhl unrelated renal cell carcinoma [J].Mol Cancer，2009,8：31.

[8] RICKETTS CJ，MORRIS MR，GENTLE D，et al.Genome-wide cpg island methylation analysis implicates novel genes in the pathogenesis of renal cell carcinoma [J].Epigenetics，2012,7(3):278-290.

[9] HU CY，MOHTAT D，YU Y，et al.Kidney cancer is characterized by aberrant methylation of tissue-specific enhancers that are prognostic for overall survival [J].Clin Cancer Res，2014,20(16):4349-4360.

[10] TEZVAL H，DUBROWINSKAJA N，PETERS I，et al.Tumor specific epigenetic silencing of corticotropin releasing hormone -binding protein in renal cell carcinoma：Association of hypermethylation and metastasis [J].PLoS One，2016,11(10):e0163873.

[11] DU Z，LI L，HUANG X，et al.The epigenetic modifier chd5 functions as a novel tumor suppressor for renal cell carcinoma and is predominantly inactivated by promoter cpg methylation [J].Oncotarget，2016,7(16):21618-21630.

[12] NAKAMURA R，OYAMA T，TAJIRI R，et al.Expression and regulatory effects on cancer cell behavior of nell1 and nell2 in human renal cell carcinoma [J].Cancer Sci，2015,106(5):656-664.

[13] LIU Q，JIN J，YING J，et al.Epigenetic inactivation of the candidate tumor suppressor gene asc/tms1 in human renal cell carcinoma and its role as a potential therapeutic target [J].Oncotarget，2015,6(26):22706-22723.

[14] MITSUI Y，HIRATA H，ARICHI N，et al.Inactivation of bone morphogenetic protein 2 may predict clinical outcome and poor overall survival for renal cell carcinoma through epigenetic pathways [J].Oncotarget，2015,6(11):9577-9591.

[15] MENDOZA-PEREZ J，GU J，HERRERA LA，et al.Genomic DNA hypomethylation and risk of renal cell carcinoma：A case-control study [J].Clin Cancer Res，2016,22(8):2074-2082.

[16] HAUSER S，ZAHALKA T，FECHNER G，et al.Serum DNA hypermethylation in patients with kidney cancer：Results of a prospective study [J].Anticancer Res，2013,33(10):4651-4656.

[17] DE MARTINO M，KLATTE T，HAITEL A，et al.Serum cell-free DNA in renal cell carcinoma：A diagnostic and prognostic marker [J].Cancer，2012,118(1):82-90.

[18] XIN J，XU R，LIN S，et al.Clinical potential of tcf21 methylation in the diagnosis of renal cell carcinoma [J].Oncol Lett，2016,12(2):1265-1270.

[19] ZHOU J，LUO J，WU K，et al.Loss of dab2ip in rcc cells enhances their growth and resistance to mtor-targeted therapies [J].Oncogene，2016,35(35):4663-4674.

[20] WANG ZR，WEI JH，ZHOU JC，et al.Validation of dab2ip methylation and its relative significance in predicting outcome in renal cell carcinoma [J].Oncotarget，2016,7(21):31508-31519.

[21] KLACZ J，WIERZBICKI PM，WRONSKA A，et al.Decreased expression of rassf1a tumor suppressor gene is associated with worse prognosis in clear cell renal cell carcinoma[J].Int J Oncol，2016,48(1):55-66.

[22] LIU WS，LIU YD，FU Q，et al.Prognostic significance of ubiquinol-cytochrome c reductase hinge protein expression in patients with clear cell renal cell carcinoma [J].Am J Cancer Res，2016,6(4):797-805.

[23] FISEL P，KRUCK S，WINTER S，et al.DNA methylation of the slc16a3 promoter regulates expression of the human lactate transporter mct4 in renal cancer with consequences for clinical outcome [J].Clin Cancer Res，2013,19(18):5170-5181.

[24] VAN VLODROP IJ，JOOSTEN SC，DE MEYER T，et al.A four-gene promoter methylation marker panel consisting of grem1，neurl，lad1 and nefh predicts survival of clear cell renal cell cancer patients [J].Clin Cancer Res，2016.CCR-16-1236.

[25] WEI JH，HADDAD A，WU KJ，et al.A cpg-methylation-based assay to predict survival in clear cell renal cell carcinoma [J].Nat Commun，2015,6：8699.

[26] DECKERS IA，SCHOUTEN LJ，VAN NESTE L，et al.Promoter methylation of cdo1 identifies clear-cell renal cell cancer patients with poor survival outcome [J].Clin Cancer Res，2015,21(15):3492-3500.

[27] SATO A，SEKINE M，KOBAYASHI M，et al.Induction of the connexin 32 gene by epigallocatechin-3-gallate potentiates vinblastine-induced cytotoxicity in human renal carcinoma cells [J].Chemotherapy，2013,59(3):192-199.

[28] LIU Y，ZHENG X，YU Q，et al.Epigenetic activation of the drug transporter oct2 sensitizes renal cell carcinoma to oxaliplatin [J].Sci Transl Med，2016,8(348):348ra397.

[29] CORAL S，PARISI G，NICOLAY HJ，et al.Immunomodulatory activity of sgi-110，a 5-aza-2′-deoxycytidine-containing demethylating dinucleotide [J].Cancer Immunol Immunother，2013,62(3):605-614.

[30] AMATO RJ，STEPHENSON J，HOTTE S，et al.Mg98，a second-generation dnmt1 inhibitor，in the treatment of advanced renal cell carcinoma [J].Cancer Invest，2012,30(5):415-421.