Kindlin-2在前列腺癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

任小强，张 鹏，张建国

(河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院泌尿外科，河南洛阳 471003)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是发生于前列腺的一组上皮性恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别居男性恶性肿瘤的第二位和第六位，严重威胁男性身体健康和生命安全[1-2]。然而影响前列腺癌疾病进展和预后的机制尚不完全明确，因此，探究前列腺癌发展的相关机制，以改善患者预后成为目前研究的热点。黏着斑蛋白-2(Kindlin-2)参与整合素的活化过程，影响细胞增殖、凋亡及迁移[3]。研究发现，Kindlin-2在肝细胞癌中高表达，与肝细胞癌的发生、发展密切相关，且影响肝细胞癌患者的预后[4]。YANG等[5]发现，Kindlin-2能促进前列腺癌细胞的侵袭作用，表明Kindlin-2可能参与前列腺癌疾病的发生、发展。因此本研究通过检测Kindlin-2在前列腺癌和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)组织中的表达情况，探讨Kindlin-2表达与前列腺癌临床病理特征及预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2011年1月至2014年1月在本院确诊并行根治性前列腺切除术的前列腺癌标本109例为研究对象(PCa组)，术后经组织病理学检查确认均为前列腺癌患者，平均年龄为(65.49±12.37)岁，Gleason评分：2～4分49例，5～7分39例，8～10分21例；临床分期(T分期)：≤T2a期33例，T2b期25例，≥T2c期51例；前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)水平：<10 ng/mL为53例，10～20 ng/mL为39例，>20 ng/mL为17例；危险因素分级：低危14例，中危43例，高危52例。对所有前列腺癌患者进行为期3年的随访，随访日期截止2017年1月31日。前列腺癌组纳入标准：①首次确诊为前列腺癌患者；②经前列腺电切或前列腺穿刺病理确诊为前列腺癌患者；③明确前列腺癌TNM(tumor node metastasis)分期及危险因素分级患者；④临床及随访资料完整；⑤行根治性前列腺切除术治疗。排除标准：①排除非首次前列腺癌患者；②排除其他恶性肿瘤；③排除合并糖尿病、高血压、冠心病等其他疾病患者；④排除术前行放化疗患者；⑤排除临床或随访资料不完整患者。选取同期经前列腺穿刺或前列腺电切确诊为BPH标本93例作为对照(BPH组)，平均年龄为(63.95±13.51)岁，且排除合并糖尿病、高血压、冠心病及其他恶性肿瘤的可能。

本研究经医院伦理委员会批准通过，标本的采集和研究过程均符合赫尔辛基宣言。所有入选研究对象均被告知研究目的后自愿加入研究，并签订知情同意书。

1.2主要试剂与仪器一抗(anti-Kindlin-2)、二抗、免疫组化SP试剂盒及苏木素染色剂，购自福建迈新生物公司；链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶溶液，购自福州迈新生物技术开发公司；普通光学显微镜，购自日本Olympus公司；组织芯片制作仪、石蜡切片机购自德国MICROM公司。

1.3实验方法组织标本经常规石蜡包埋，切片4 μm/片，在典型位置处做好标记后，在供体蜡块对应部位作为取材位置。采用微阵列仪在空白受体蜡块相应位置打孔(直径0.1 cm，间距0.1 cm，深度0.2～0.3 cm)，采用组织芯片制作仪在供体蜡块对应位置采集前列腺组织切片(直径1.5 mm，采样长度0.8 cm)，并置于空白受体蜡块对应小孔中，记录各组织样本所在微阵，每例前列腺组织采集1～2个位点，重复以上操作。将带有组织芯片的蜡块置于55 ℃恒温铜板，保持30 min，将其嵌入另一蜡块，待完全融合后，重复以上操作。共制作3个蜡块，包括109例前列腺癌组织和93例良性前列腺增生组织，分别记作1、2、3，蜡块凝固后切片。严格按照免疫组化二步法操作说明进行实验：常规脱蜡、水化处理，0.3%H2O2孵育20 min；高温组织修复，加入一抗(Anti- Kindlin-2，1∶50)，4 ℃过夜；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)洗3次，10 min/次；加入带有生物素标记的二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育40 min；加入链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶溶液，37 ℃孵育35 min；加入二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)试剂，显色4 min；苏木素染色剂复染；梯度脱水、透明、中性胶封片。置于光学显微镜下分析染色结果。

1.4结果判定Kindlin-2阳性染色表现为细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒。每张切片随机选取10个高倍镜视野(×200)进行观察，参照文献中方法对细胞染色情况及阳性细胞比例进行评分[6]：①按细胞的染色情况评分：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②按阳性细胞比例评分：≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。采用积分法，即最终得分=染色得分×阳性细胞比例得分，对染色结果进行判定：0～6分，为低表达；7～12分，为高表达。

2 结 果

2.1前列腺癌患者中Kindlin-2蛋白的表达水平免疫组化结果显示，Kindlin-2蛋白主要定位于细胞质，阳性细胞呈棕黄色(图1)。前列腺癌组织Kindlin-2蛋白高表达率为72.48%，明显高于良性前列腺增生组织Kindlin-2蛋白高表达率30.11%，差异有统计学意义(P<0.05,表1)。

表1 不同前列腺组织中Kindlin-2蛋白表达水平比较 (例)

图1不同前列腺组织中Kindlin-2蛋白的表达(免疫化学染色法，×200)

A：前列腺癌组织；B：良性前列腺增生组织。

2.2Kindlin-2蛋白表达与前列腺癌患者临床参数之间的关系前列腺癌患者癌组织中Kindlin-2蛋白表达水平与患者T分期、淋巴结转移情况、远处转移情况、PSA水平、Gleason评分及危险程度有关，差异有统计学意义(P<0.05)，与患者年龄、吸烟情况无关，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

2.3前列腺癌组织中Kindlin-2表达与患者生存率之间的关系前列腺癌患者中Kindlin-2高表达者3年存活率为69.62%(55/79)，明显低于Kindlin-2低表达者3年存活率90.00%(27/30)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

表2 Kindlin-2蛋白表达与患者临床参数之间的关系 [例(%)]

2.4影响前列腺癌患者预后的Cox回归分析本研究将患者Kindlin-2表达、年龄分层、吸烟情况、PSA水平、Gleason评分、临床分期(T)、淋巴结转移情况(N)、远处转移情况(M)、危险因素分级等因素，纳入影响前列腺癌患者预后的Cox回归分析模型。单因素分析结果表明，Kindlin-2表达、PSA水平、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移、远处转移和危险因素分级均是影响患者预后的危险因素。多因素Cox回归分析发现，Kindlin-2表达、PSA水平、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移、远处转移、危险因素分级是影响患者预后的独立危险因素。见表3。

表3影响前列腺患者预后单因素和多因素Cox回归分析结果

变量单因素HR95%置信区间P值多因素HR95%置信区间P值年龄1.3490.367～4.9590.247---吸烟情况1.7560.481～6.4110.129---Kindlin-2表达4.1341.768～9.6660.0002.3471.168～4.7160.000PSA水平1.9871.073～3.6800.0051.2171.097～1.3500.009Gleason评分2.9761.175～7.5380.0001.7341.076～2.7940.000临床分期1.4461.067～1.9600.0081.1391.057～1.2270.009淋巴结转移1.5261.094～2.1290.0071.2251.108～1.3540.008远处转移1.6071.278～2.0210.0071.1371.067～1.2120.009危险因素分级3.2791.437～7.4820.0002.1581.130～4.1210.000

图2前列腺癌组织中Kindlin-2表达与患者生存率之间的关系

3 讨 论

前列腺癌具有典型的异质性:一些前列腺癌早期症状不明显，且疾病发展较慢；另一些则发展迅速，甚至出现骨及其他组织器官转移，导致死亡。虽然前列腺癌的诊治技术已取得一定完善和进步，但前列腺癌仍然是严重威胁男性生命健康的恶性肿瘤之一。2015年，国家癌症中心公布，我国约有6.03万例前列腺癌患者，其中死亡2.66万例，死亡率高达44.11%[7]。探索前列腺癌的发病机制，寻找有效生物分子标记，可为前列腺癌的临床诊断和治疗提供新思路。

黏着斑蛋白-2(Kindlin-2)又名丝裂诱导基因(mitogen-inducible gene-2，MIG-2)，属于黏着斑蛋白家族，存在于多种细胞、组织中，参与整合素的活化过程，还可与黏附结构蛋白相互作用，参与调解细胞增殖、凋亡、迁移等生理过程[8-9]。研究发现，Kindlin-2在乳腺癌[10]、直肠癌[11]、肝细胞癌[12]等多种恶性肿瘤中表达上调，促进肿瘤细胞的侵袭、转移。刘冬等[13]发现，Kindlin-2在肝癌组织中的表达显著升高，且与肿瘤直径、门静脉侵犯及肿瘤微血管生成相关。XUE等[14]发现，Kindlin-2的表达与乳腺癌患者乳腺结节的胶原强度和最大弹性呈正相关，且Kindlin-2表达与乳腺癌淋巴结转移有关。YOSHIDA等[15]发现，Kindlin-2在胰腺癌组织中高表达，参与胰腺癌疾病的发展。SHEN等[16]发现，Kindlin-2在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且其表达与患者的TNM分期、淋巴结转移、肿瘤细胞侵袭、生存率等有关。YANG等[5]利用RNAi技术发现，下调Kindlin-2表达可有效抑制前列腺癌细胞系的侵袭能力，过表达Kindlin-2可促进前列腺癌细胞系的侵袭能力，推测Kindlin-2具有促进肿瘤细胞侵袭的作用。本研究对109例前列腺癌患者前列腺组织标本进行检测，发现前列腺癌患者Kindlin-2高表达率显著增高，与Kindlin-2在乳腺癌、胰腺癌、胃癌等恶性肿瘤中的表达模式一致，提示Kindlin-2高表达可能参与前列腺癌的发生。进一步研究发现，临床分期T3～T4期、有淋巴结转移、有远处转移患者Kindlin-2高表达率明显高于T1～T2期、无淋巴结转移、无远处转移患者；Kindlin-2在肿瘤组织中高表达率随患者血清PSA水平、Gleason评分及危险因素级别的升高而升高，表明Kindlin-2表达与患者血清PSA水平、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移、远处转移、危险因素分级有关。提示Kindlin-2参与前列腺癌疾病的发展，与疾病的病理分化有关。

近年来，对于前列腺癌的诊断和治疗方法已取得很大进步，然而其死亡率依然很高[17]，因此，亟需寻找有效生物标志物来判断前列腺癌患者预后情况。MAHAWITHITWONG等[18]发现，Kindlin-2阳性表达的胰腺癌患者生存率明显低于阴性表达患者，是不良预后的独立影响因素。YAN等[19]发现，Kindlin-2高表达与透明细胞肾细胞癌患者的血液转移和不良预后密切相关。WU等[20]发现，膀胱癌患者中Kindlin-2高表达者的生存时间明显短于Kindlin-2低表达者，是导致不良预后的独立因素之一。本研究发现前列腺癌患者Kindlin-2高表达者的3年存活率明显低于Kindlin-2低表达者。进一步对影响患者3年生存率的相关因素进行分析，单因素分析结果表明，Kindlin-2表达、PSA水平、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移、远处转移和危险因素分级是影响患者预后的危险因素。多因素Cox回归分析发现，Kindlin-2表达、PSA水平、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移、远处转移、危险因素分级是影响患者预后的独立危险因素。本研究发现Kindlin-2高表达可降低前列腺癌患者3年生存率，影响前列腺癌患者生存情况。推测Kindlin-2表达情况可用于诊断前列腺癌及预测患者预后情况。

综上所述，Kindlin-2在前列腺癌患者中高表达，与前列腺癌患者血清PSA水平、Gleason评分、临床分期、淋巴结转移、远处转移、危险因素分级有关，且影响患者3年生存情况，推测Kindlin-2可作为诊断前列腺癌及判断患者预后的有效生物标志物。

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