低温胁迫对闽楠幼苗形态及生理特性的影响

安常蓉，韦小丽，叶嘉俊，王明丹，田肖箫

(1.贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025；2.安龙县洒雨镇林业站，贵州 安龙 552404)

温度对林木生长发育具有重要作用，是决定林木地域分布、生长发育以及林木生物产量的重要因素。林木受低温的危害分为冻害和冷害。冷害是指零上低温对林木的伤害，冻害则是指零下的低温对林木的伤害[1]。相关研究表明，林木对冷害的生理生化反应主要表现在根系吸收能力下降、膜系统受损、物质代谢失调和呼吸代谢异常；而冻害对林木的影响表现在含水量降低、保护物质积累和脱落酸含量增高，促进植物进入休眠[2]。2008年南方特大凝冻灾害发生后，越来越多的研究者们致力于林木抗冻性的调查研究[3-6]，研究表明雪凝天气会直接破坏森林植物、改变森林生态系统的结构组成、降低生态系统的功能与效益和影响生态系统的演替方向。罗在柒等[7-8]研究贵州主要乡土阔叶树种幼苗冻害调查及耐冻树种选择，表明幼苗受冻程度主要与树种耐寒特性、土壤含水状况、植株木质化程度及苗木质量有关。任军等人对近几年来国内外关于植物抗寒性与形态结构、膜系统、保护性酶系统、渗透调节物质、基因等因素的关系作全面综述，分析认为研究植物抗寒性的生态习性、生理生化规律、环境因素以及各个因素之间的调控机理，在理论基础和实际生产上具有重要价值[9]。

闽楠〔Phoebebournei(Hemsl.)Yang〕是我国珍贵用材树种，渐危种。分布于浙江、福建、江西、广东、贵州等地区海拔200-1 000m的常绿阔叶林中，被列为国家二级保护植物[10]。由于闽楠的渐危，近年来对闽楠的研究也越来越受到重视，对闽楠的研究主要集中在种群生态[11-14]、育苗技术[15-19]、人工林经营[20-22]等方面，而关于闽楠幼苗对低温的抗性尚无报道。冬季低温是影响苗木新陈代谢和生长发育的重要逆境因子之一，幼苗能否忍耐低温逆境成苗直接关系到林木育苗的成败。因此，本研究拟采取人工模拟不同低温条件，对一年生闽楠幼苗进行冷害培养试验和冻害及危害后的恢复试验，阐述低温胁迫后闽楠幼苗叶片形态和生理生化指标的变化，以探讨闽楠幼苗对持续冷害和短时间冻害的响应，能够承受的低温极限及受害后的恢复能力，为闽楠苗木培育以及人工栽培中应对低温逆境采取相应技术措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

试验处理分两部分，即冷害和冻害处理。冷害处理是当盆栽闽楠苗完全恢复生长，抽出明显新梢后(当年10月)，将其移入4个RXZ智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂)中，分别设置25℃(对照)和3个冷害温度即10℃、5℃和0℃，每个温度处理的相对湿度和光照强度均固定设为80%、1 100Lx，光周期为10h/14h(光/暗)。在处理前浇水使苗盆中的土壤湿度基本一致，而持续处理过程中不需要补充水分，为了减少处理过程中的水分蒸发，用留有大小不一带孔的塑料薄膜覆盖盆表面。处理后定期观察每个温度处理下闽楠幼苗的形态变化，并分别在处理2d、10d、20d取样测定苗木的生理生化指标。冻害处理是将闽楠幼苗放置在可控低温冰箱即-5℃下冻害处理24h，处理后取出一部分幼苗置于25℃的气候箱中分别恢复1h、12h，记录处理后的形态变化并取样测定生理生化指标。以上每个处理3个重复，每个重复5株苗，即1个处理15盆苗。

1.3 指标的测定

细胞质膜透性测定参照电导率法[23]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定用氮蓝四唑法[23]；叶绿素含量测定采用混合液直接浸提法[24]；丙二醛(MDA)含量测定参照硫代巴比妥酸法[25]；脯氨酸(pro)含量测定采用酸性茚三酮法[26]。

1.4 数据计算

半致死温度的计算参考Logistic曲线方程求得[27]。

1.5 数据统计与分析

采用Excel对数据进行计算整理和SPSS进行方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对闽楠幼苗形态的影响

对0-10℃低温胁迫下闽楠幼苗的形态观察发现，2d内，各温度处理下植株的叶形、叶色和枝梢形态与对照相比未见明显变化；0℃处理，在10d以内，闽楠叶色仍未见明显变化，但成熟叶有明显增厚的迹象，顶梢嫩叶可见萎蔫下垂；20d时，10℃处理的闽楠成熟叶片萎蔫下垂并伴有少许叶片脱落现象，而0℃处理的叶片还伴有失绿现象。-5℃处理24h后，闽楠幼苗叶片失绿且中下部成熟叶下垂，相继叶面出现结冰，叶脉纹理加粗易脱落；常温恢复1h和12h后，叶片出现反卷，失绿现象严重，重度萎蔫且严重脱落。可见，随着温度的降低和处理时间延长，闽楠幼苗叶片发生了较为明显的形态变化；而短时间的冻害处理和常温恢复后闽楠幼苗叶片发生了显著性变化。

2.2 低温胁迫对闽楠幼苗生理生化的影响

2.2.1 低温胁迫2d对闽楠幼苗生理生化的影响

低温胁迫2d，不同温度处理的闽楠幼苗叶绿素含量、MDA含量和脯氨酸含量相比对照组显著降低(P<0.05)，而细胞质膜透性、SOD酶活性与对照组相比无显著变化(表1)。表明2d的胁迫下闽楠幼苗具有一定的抗寒能力，细胞组织保护能力较强。

2.2.2 低温胁迫10d对闽楠幼苗生理生化的影响

随着低温胁迫时间延长，闽楠幼苗的生理生化指标均发生了显著性变化，见表2。

表1 低温胁迫2d闽楠幼苗生理生化分析

注：表中数值为“平均值±标准差”；同一列中标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

表2 低温胁迫10d闽楠幼苗生理生化分析

由表2可知，幼苗叶绿素含量与对照相比显著下降(P<0.05)，但与胁迫2d相比，叶绿素含量下降不明显；细胞质膜透性和SOD酶活性与对照相比显著升高(P<0.05)，0℃处理的细胞质膜透性和SOD酶活性升高最明显，分别比对照高1.3倍和1.4倍；10℃和5℃处理的MDA含量与对照相比显著下降，而0℃处理则与对照相比不显著，但与胁迫2d相比，各处理的幼苗叶片MDA含量明显下降；与胁迫2d相比，幼苗叶片脯氨酸含量明显增加但均显著小于对照，其原因是低温下闽楠幼苗通过脯氨酸积累增强渗透调节的能力低于高温的影响。综上所述，胁迫10d时，闽楠幼苗叶片内叶绿素对低温的胁迫比较敏感，导致其色素合成继续受阻，此时，细胞组织开始受到一定的影响，质膜透性逐渐增大，但MDA含量呈下降趋势，下降原因是由于SOD酶活性增加较快，较高的SOD酶活性能够抑制膜脂质过氧化作用，使得MDA含量下降。

2.2.3 低温胁迫20d对闽楠幼苗生理生化的影响

由表3可知，随着低温胁迫时间的持续，闽楠幼苗叶片细胞质膜透性、MDA含量、SOD酶活性显著增加(P<0.05)，而叶绿素含量和脯氨酸含量继续显著降低(P<0.05)。其中，10℃、5℃和0℃处理的叶片细胞质膜透性与对照相比显著增大，分别比对照高133.70%、147.94%和159.18%；同样，10℃、5℃和0℃处理的SOD酶活性与对照相比显著增加，分别比对照高109.82%、109.03%和105.49%。与胁迫10d相比，幼苗叶片MDA含量和脯氨酸含量明显增加，但各温度处理的脯氨酸含量均显著低于对照。另外，0℃处理的幼苗除细胞质膜透性明显高于其他温度处理外，叶绿素含量、MDA含量、SOD活性和脯氨酸含量均低于10℃和5℃处理，说明在此温度内，植物组织受到严重胁迫，加剧细胞质膜的破坏，显著降低植物的抗寒能力。

表3 低温胁迫20d闽楠幼苗生理生化分析

2.2.4 冻害及恢复处理对闽楠幼苗生理生化的影响

表4表明，-5℃处理24h和常温恢复1h和12h后，闽楠幼苗叶片叶绿素含量、MDA含量、SOD酶活性和脯氨酸含量发生显著变化，而细胞质膜透性变化不显著(P>0.05)。其中，与-5℃/24h处理相比，常温恢复1h、12h后其叶片叶绿素含量显著下降，说明闽楠幼苗经过短时间的冻害后，其叶绿素结构遭受严重破坏，又经过短时间的常温恢复，其叶绿素合成结构彻底被破坏；-5℃/24h及常温恢复处理后，细胞质膜透性呈现先增加后降低趋势，常温恢复1h的细胞质膜透性最大，随着恢复时间延长，叶片细胞质膜透性降低且低于冻害处理，即冻害后再进行极短时间的恢复对细胞质膜伤害最大且不可逆，而随着恢复时间增加，植株在冻害过程中没有完全受到伤害的组织开始缓解；-5℃/24h及常温恢复处理后，闽楠幼苗的SOD酶活性高于持续的冷害处理，表明短时间的冻害和常温恢复1h处理，闽楠幼苗对低温具有一定的防御反应，即引起SOD酶活性的增加，以此来减缓伤害，但常温恢复12h后，幼苗SOD酶活性降低，可见植株遭受到严重破坏；-5℃/24h处理，闽楠幼苗MDA含量略小于20d的冷害处理，即短时间的冻害处理下植物组织受到严重胁迫，体内膜脂过氧化物作用不断加强，经过常温1h的恢复后，叶片MDA含量与冻害处理相比呈下降趋势，这是由于SOD酶活性增加的缘故，常温恢复12h后，幼苗叶片的SOD酶活性下降，而MDA含量增加，说明延长恢复时间，闽楠的防御系统已受到较严重的伤害，植株恢复能力较弱；-5℃/24h及常温恢复处理后，闽楠幼苗叶片脯氨酸含量呈先增加后降低的趋势，其短时间的冻害和1h的常温恢复处理使得叶片脯氨酸含量增加，这是由于游离脯氨酸对低温冻害及常温恢复反应敏感，但随着恢复时间延长，脯氨酸含量显著下降，表明细胞受到严重冻害而难以恢复。

表4 冻害及恢复处理下闽楠幼苗生理生化的分析

2.3 闽楠幼苗的半致死温度

根据闽楠幼苗叶片在不同温度处理下的细胞质膜透性，用Logistic方程y=k/(1+ae-bx)拟合，计算该Logistic方程的二阶导数，并令其等于0，则可获得曲线拐点，x=Ln(lna)/b。本试验根据Logistic方程得出闽楠幼苗冻害胁迫的半致死温度为-2.9℃。由闽楠幼苗的半致死温度及在零上低温时其细胞质膜透性的变化规律，可以初步判定，0℃是闽楠幼苗受到伤害的一个临界值，超过20d的0℃低温，幼苗的伤害程度接近于半致死温度的伤害。在生产实践中，闽楠植株可以通过自身的积极响应以适应5℃以上的低温环境，但随着温度的降低或持续长时间的低温或者短期的冻害天气将会严重影响该树种的正常生理代谢，对其苗木的生长发育也会造成较大伤害。

3 结论与讨论

在正常情况下，植株体内的各种生理生化反应都是比较稳定而协调的，当植物受到逆境胁迫时，其体内的指标都相应地发生变化，这是植物对逆境做出的反应[28]。因此可以通过冷害和冻害以及常温恢复处理下植物体内生理生化指标的变化，探究其幼苗的受害程度，从而为林木育苗防寒防冻措施的制定提供理论依据。

叶片是植物进化过程中对环境变化比较敏感且可塑性较大的器官，环境变化常导致叶的形态解剖结构的响应与适应[29]。通常植物通过调整细胞的生理生化状态来适应短期的环境变化，通过结构发育改变适应长期的环境变化。本试验结果表明，2d内，各温度处理下植株的叶形、叶色和枝梢形态与对照相比未见明显变化；0℃处理，在10d以内，闽楠叶色仍未见明显变化，但成熟叶有明显增厚的迹象，顶梢嫩叶可见萎蔫下垂；20d时，10℃处理的闽楠成熟叶片萎蔫下垂并伴有少许叶片脱落现象，而0℃处理的叶片还伴有失绿现象。-5℃处理24h时闽楠幼苗叶片出现失绿、结冰和下垂的现象，在25℃条件下恢复1h和12h后，叶片重度萎蔫，严重脱落。因此，在低温胁迫下，闽楠幼苗叶片形态的变化可能与低温导致植物生理脱水有关[30]，而叶色的变化则与低温下新叶绿素合成降低、原有叶绿素破坏有关。

低温胁迫可引起植物体内活性氧代谢失调，导致叶绿体结构被破坏，从而影响光合速率[31]。前人的研究表明低温胁迫会引起植物叶绿素含量的下降[32-33]。本试验中，闽楠幼苗叶片内叶绿素含量随温度的降低和胁迫时间的延长而持续下降，这和前人的结论是一致的，其下降原因是持续低温处理导致叶绿素合成受阻，而短期冻害及常温恢复处理则直接破坏叶绿素结构，导致其叶片失绿。叶绿素含量的减少一方面是对低温胁迫的反应，另一方面也是长期适应低温的响应[34]。

植物体内细胞的膜系统以及细胞器膜体系与植物抗寒性有十分密切的关系，以质膜相对透性来表示植物在低温伤害下细胞质膜透性的变化是鉴定植物抗寒性较常用的方法[35-37]。本试验结果表明，随着冷害温度的降低和时间的延长，闽楠幼苗叶片细胞质膜透性显著增大。-5℃/24h及常温恢复处理后，细胞质膜透性呈现先增加后降低趋势，常温恢复1h的细胞质膜透性最大，随着恢复时间延长，叶片细胞质膜透性降低且低于冻害处理，说明冻害后再进行极短时间的恢复对细胞质膜伤害最大且不可逆，但随着恢复时间增加，植株在冻害过程中没有完全受到伤害的组织开始缓解。

伴随着SOD活性的变化，细胞内的MDA含量也发生相应的变化。冯建灿等人发现低温下喜树(Camptothecaacuminata)幼苗SOD活性与MDA含量之间存在着一定程度的负相关[38]。在试实验中，低温处理10d时，闽楠幼苗SOD活性与对照相比显著上升，而MDA含量与对照相比呈下降趋势；-5℃冻害处理24h，幼苗的SOD活性显著增加，25℃恢复1h后SOD活性持续上升，恢复12h后则有所下降，MDA含量变化与SOD活性变化趋势相反。可见，本研究结论与前人一致。值得关注的是冻害下闽楠幼苗的SOD活性显著高于冷害处理，但MDA含量则与不同时间的冷害处理接近，说明冻害下高的SOD活性显著抑制了MDA的产生。由此可见，SOD酶活性和MDA含量对低温变化十分敏感，是衡量闽楠幼苗抗寒性较好的指标[39]。

脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，它能够维持细胞正常代谢，消除有毒物质，保护膜蛋白和保持水分，可作为抗寒性鉴定指标之一[40-41]。本试验中，随着冷害温度的降低和处理时间的延长，闽楠幼苗的脯氨酸含量持续增加，但都低于对照，说明低温下闽楠幼苗通过脯氨酸积累增强渗透调节的能力低于高温的影响，与前人[42]的研究一致。冻害处理下，叶片内脯氨酸含量与冷害处理相比则明显下降，且常温恢复1h、12h均不能恢复，说明-5℃处理使幼苗受到严重伤害而失去渗透调节能力以致后期恢复困难。不同植物在不同条件下不一定通过同一途径来抵抗外界的不良环境，从脯氨酸在逆境条件下积累的途径来看，它既可能有适应性的意义，也有可能是细胞结构和功能受损伤的表现，因此植物抗逆境的途径是多种多样的[43]。

综上所述，闽楠幼苗在经过长时间的冷害处理，能够通过自身保护酶作用和渗透调节物质的积累，使植株能够维持10-20d的正常生长，超过20d，幼苗叶形发生明显的变化且生理特性与对照相比显著上升或下降，说明此时苗木已遭受严重的低温伤害。另外，对闽楠幼苗进行短时间的冻害及常温恢复处理时，幼苗叶形和大部分生理生化指标均发生显著的变化，表明植株的生理代谢受到严重影响以致恢复生长较困难。在生产实践中，冬季有持续长时间的冷害或短期的冻害天气，因此，在进行闽楠苗木培育时，应根据温度的变化及时做好防寒措施，保证苗木正常生理代谢和生长发育。总之，在低温胁迫下，植物会通过各种生理生化变化来适应低温环境以更好地生长。但该试验仅测了一年生闽楠幼苗在低温胁迫下的形态变化和部分生理生化指标，如果要深入地研究闽楠幼苗的抗寒性还需结合幼苗光合特性和其他生理指标(如POD、CAT等)以及不同的生长发育阶段来进行综合分析。此外，还需细化温度梯度的设置，真正了解一年生幼苗忍耐的极限温度和持续低温的最长时间。

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