云南产不同色型玛咖对SD雌性大鼠肠道健康的影响

朱玉竹，朱萍

（1.云南农业大学附属中学，云南昆明650200；2.重庆大学生物工程学院，重庆400044）

玛咖（Lepdium meyenii Walp，Maca）为十字花科（Brassicaceae）独行菜属（Lepidium）草本植物，原产于海拔 3 500 m～4 000 m 的秘鲁安第斯山脉（AndesPeru）[1－2]。从2002年我国正式批准引种玛咖以来，逐渐形成以云南丽江为中心，逐渐辐射至昭通、会泽等云南其他地州及吉林、新疆和湖南等多个省市区。2011年，国家卫生部第31号公告批准玛咖粉作为“新资源食品”，玛咖迎来了快速发展期。玛咖含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质、多糖等营养物质和玛咖烯、玛咖酰胺等生物碱活性成分，是药食同源作物，具有增强性功能[3－4]、抗疲劳、抗氧化[5]、提高生育力[6]、减缓更年期综合症[7]等作用。现已研究表明，云南产不同色型，不同产地的玛咖在营养物质及生理功能上存在差异，如，云南黑、紫、黄、绿玛咖中多糖含量为紫色（7.02%）＞黑色（6.93%）＞绿色（6.75%）＞黄色（6.53%）[8]；生物碱含量依次为紫色（4.4078mg/g）、白色（2.919 3 mg/g）、黄色（2.224 1 mg/g），差异达到极显著水平（P＜0.01）[9]；张毅[10]研究表明，云南紫、黄、白玛咖对小鼠抗疲劳、非特异性免疫功能、降血脂、缺氧耐受力及抗氧化方面的效果差异，结果表明紫色玛咖效果最好，白色玛咖效果较差。

肠道健康与人体健康关系密切，现已有大量研究表明肠道菌群与免疫类疾病、胃肠道疾病、糖尿病等存在关联。另外，肠道是口服药物在体内代谢的重要场所[11]，而玛咖作为一种新的药食同源植物[12]，其对肠道健康影响的研究却非常少。因此研究玛咖对肠道微环境和肠道菌群的影响显得十分必要。本文以云南产不同色型玛咖对SD雌性大鼠肠道微环境和肠道菌群的影响，为玛咖的开发与应用提供科学的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玛咖：云南省刚捷生物科技有限公司购买；SD雌性大鼠，体质量150 g～160 g，40只：重庆腾鑫生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（渝）20120008；基础饲料：重庆腾鑫生物技术有限公司提供；戊酸、异戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸（色谱纯）：梯希爱化成工业发展有限公司；巴豆酸（色谱纯）：日本东京天成工业株式会社。

1.2 仪器与设备

Light Cycler Nano荧光定量PCR仪：美国罗氏公司；GC－2010高效气相色谱仪、UV－2450紫外分光光度计：日本岛津公司；H1MG酶标仪：美国基因有限公司；3－18k冷冻离心机：德国SIGMA公司；S1000梯度PCR仪：美国BIO－RAD公司；Nano Drop 2000微量紫外分光光度：美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 试验样品的制备与剂量确定

玛咖作为一种可食用植物，其成人每日推荐摄入量为25 g，中国人平均体质量为60 kg，即成人每日用玛咖剂量为0.42 g/（kg·bw）[13－15]。

将玛咖切片后于50℃烘干至恒重，经中药粉碎机粉碎后过150目筛。取玛咖干粉6 g溶于1%羧甲基纤维素钠溶液并定容至50 mL，即得0.12 g/mL浓度样品悬浮液，4℃保存备用[16]。

1.3.2 动物分组和饲养

将40只SD雌性大鼠按体质量随机分为空白对照组，黑玛咖，紫玛咖、黄玛咖、白玛咖，各组8只。每只大鼠独立饲养于（25 cm×15 cm×15 cm）不锈钢笼里中，动物房温度控制在（25±1）℃，相对湿度55%，昼夜循环周期12 h，实验组每日灌胃0.42 g/（kg·bw）的1%羧甲基纤维素钠玛咖干粉（150目）悬浮液，空白组灌胃等体积1%羧甲基纤维素钠溶液，饲养期间自由采食基础饲料和饮水饲养，每天记录一次大鼠采食量，每3 d称量一次大鼠体质量，同时调整灌胃量，喂养28 d，禁食12 h后称重。乙醚麻醉后断头处死，解剖。取出盲肠组织，称重后，纵向剖开，取100 g盲肠内容物于1.5 mL无RNA酶离心管中，保存于－80℃用于盲肠内容物中菌群的测定，收集剩余的盲肠内容物保存于－20℃冰箱，备用。用4℃生理盐水清洗盲肠壁，吸水纸吸干，称重后并计算其表面积。

1.3.3 饲料效率的测定

1.3.4 盲肠壁面积测定

参考叶敏等[17]方法进行盲肠壁面积的测定，用4℃生理盐水将盲肠壁洗净后，在划有标准刻度的坐标纸上充分展开后，铅笔勾画出其轮廓，待坐标纸干燥后复印于打印纸上，剪下轮廓图，电子天平精密称量轮廓纸的质量A1（g），以及1cm2打印纸的质量A0（g/cm2），并按以下公式计算。

1.3.5 pH 值测定

称取一定质量的盲肠内容物于10 mL去离子水预处理离心管中，加入质量与体积为1∶10去离子水，旋涡1min，静置2min，测上清液pH值。

1.3.6 短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的测定

准确称取0.2 g盲肠内容物另入10 mL离心管中，另入2 mL含有5 mmol/L巴豆酸的10 mmol/L氢氧化钠溶液，4℃，4 000 r/min离心15min，吸取上清液于5 mL离心管中；4℃，10 000 r/min离心15min，吸取上清液 1 mL，过滤（0.25 μm）至 2 mL 进样小瓶中待测[4]。

气相色谱条件：柱流量 0.95mL/min，进样量 1μL，进样口温度220℃，柱温90℃、平衡时间0.5min，5℃/min升温至150℃，保留时间7min；氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min，检测器温度 230℃[5]。

1.3.7 游离氨含量测定

将1.3.5预处理的盲肠内容物样品于4℃，4 000 r/min离心5min，吸取上清液1 mL，依次加入1 mL含有0.001 mol/L Na2Fe（CN）5NO·2H2O 的 0.5 mol/L 苯酚溶液和 1 mL 含有 0.03 mol/L NaClO 的 0.625 mol/L NaOH溶液，60℃保温5min，625 nm波长下测吸光度[10]。

1.3.8 盲肠内容物微生物的测定

按照粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有效公司）的说明书进行提取。参照文献[18]设计各肠道菌群聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物，并由华大基因合成，引物序列及扩增片段见表1。反转录·聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT－PCR）反应体系为10 μL：SYBR Green Supermix（Bio－Rad 公司）4.2 μL，20 μmol/L上、下游引物各 0.3 μL；焦炭酸二乙酯（oiethy pyrocarbonate，DEPC）水 4.2 μL，100 ng/μL cDNA 模板 1.0 μL。反应条件：95℃预变性30 s；40次循环包含95℃5 s；60℃30 s；65℃5 s；95℃5 s。计算出各种细菌的Ct值。

表1 各细菌引物序列及产物长度Table 1 Primer sequences and product lengths of different bacteriabp

1.4 统计分析

实验结果以mean±SD表示，各组间差异显著性采用SPSS 16.0软件分析，各组间比较采用单因素方差分析，用Duncan法分析显著性，P＜0.05被认为有显著差异。

2 结果

2.1 玛咖对实验大鼠体质量、采食量及饲料效率的影响

玛咖对实验大鼠采食量、体质量增加量及饲料效率的影响见表2。

表2 玛咖对实验大鼠采食量、体质量增加量及饲料效率的影响（n=8）Table 2 The effects of Maca on feed intake，weight gain and feed efficiency in SD female rats（n=8）

由表2可知，与空白对照组相比，黑玛咖，紫玛咖，黄玛咖和白玛咖均可增加实验大鼠体质量，其中黑玛咖，紫玛咖和黄玛咖对实验大鼠体质量的增加量影响显著（P＜0.05），体质量增加大小排序分别为：黑玛咖＞紫玛咖＞黄玛咖＞白玛咖；不同组别玛咖均有降低实验大鼠采食量的趋势，其中黑玛咖和紫玛咖可显著（P＜0.05）降低实验大鼠采食量。不同组别玛咖均可提高实验大鼠饲料效率，其中黑玛咖，紫玛咖和黄玛咖可显著（P＜0.05）提高实验大鼠饲料效率。

2.2 玛咖对实验大鼠盲肠及其微环境的影响

玛咖对实验大鼠盲肠及其微环境的影响见表3。

由表3可知，与空白对照组相比，各实验组均有降低实验大鼠肓肠总质量的趋势，其中黑玛咖和紫玛咖降低效果显著（P＜0.05）；黑玛咖，紫玛咖和黄玛咖显著（P＜0.05）增加实验大鼠肓肠壁质量，白玛咖也有增加实验大鼠肓肠壁质量的作用，但不显著（P＞0.05）；各实验组均有增加实验大鼠盲肠壁表面积的趋势，其中泽黑玛咖和紫玛咖可显著（P＜0.05）增加实验大鼠盲肠壁面积。与空白对照组相比，各实验组均有降低实验大鼠盲肠内容物pH值和游离氨的作用，其中泽黑玛咖和紫玛咖可显著（P＜0.05）降低实验大鼠盲肠内容物pH值和游离氨含量；各实验组均有升高实验大鼠盲肠内容物含水量的趋势，但未达到统计学意义。

表3 玛咖对实验大鼠盲肠及其微环境的影响（n=8）Table 3 The effects of Maca on cecum and its microenvironment in SD female rats（n=8）

2.3 玛咖对实验大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响

玛咖对实验大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响见表4。

表4 玛咖对实验大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响（n=8）Table 4 The effects of Maca on short chain fatty acids of cecal contents in SD female rats（n=8）μmol/g

由表4可知，与空白对照组相比，各实验组均可显著（P＜0.05）升高实验大鼠盲肠内容物中乙酸的含量，分别升高了 40.30%、27.77%、21.76%和 22.61%；有升高实验大鼠盲肠内容物中丙酸和丁酸含量的趋势，其中黑玛咖、紫玛咖和黄玛咖可著升高（P＜0.05），其中丙酸的含量分别升高了 19.88%、12.09%、9.44%和3.07%，丁酸的含量分别升高了 20.14%、17.26%、9.83%和1.19%；而各实验组对戊酸、异丁酸和异戊酸含量的影响有降低的趋势，其中黑玛咖对异戊酸含量有显著（P＜0.05）降低，其它各组均不显著（P＞0.05）；各实验组均可升高实验大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸（short－chain fatty acids，SCFA）的含量，其中黑玛咖和紫玛咖对实验大鼠盲肠内容物中SCFA含量影响显著（P＜0.05），各实验组 SCFA 含量分别升高了 16.30%、11.24%、7.90%和 6.75%；各实验组均有降低实验大鼠盲肠内容物中支链脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFA）含量的趋势，但不显著（P＞0.05）。

2.4 玛咖对实验大鼠盲肠内容物中微生物的影响

玛咖对实验大鼠盲肠内容物中微生物的影响见表5。

表5 玛咖对实验大鼠盲肠内容物中微生物的影响（n=8）Table 5 The effects of Maca on microorganisms of cecal contents in SD female rats（n=8）log10 copies/g

由表5可知，与空白对照组相比，各实验组肠球菌数量降低，其中黑玛咖、紫玛咖和黄玛咖降低量显著（P＜0.05），而白玛咖对肠杆菌同样有降低趋势的影响，但不显著（P＞0.05）；各实验组有升高乳酸杆菌和拟杆菌数量的趋势，但不显著（P＞0.05）；各实验组均有升高实验大鼠盲肠内容物中双歧杆菌和梭菌数量的趋势，其中黑玛咖和紫玛咖影响显著（P＜0.05）。

3 讨论

本实验的主要目的是探讨云南产不同色型玛咖对SD雌性大鼠肠道健康的影响。在机体运动量与基础代谢量一致的条件下，大鼠体质量、采食量和饲料效率可间接反映食物在胃肠道内消化吸收情况，灌胃玛咖后，大鼠的体质量和饲料效率增加，而采食量却有降低，说明玛咖能够促进饲料的消化利用率，可能与玛咖中的膳食纤维含量有关，玛咖是公认的优质膳食纤维和蛋白质原料来源，研究表明，云南产黑玛咖和黄玛咖中膳食纤维含量达37.41%和33.46%，而粗蛋白质含量分别为14.74%和 12.48%[19－20]。短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的组成和总量可以间接反应机体肠道内厌氧菌的数量和代谢情况，SCFA是由肠道菌群利用宿主不易消化的糖类、蛋白或内源性底物等酵解而产生的重要代谢产物[21]，可促进盲肠壁生长，表面积扩大，质量上升。玛咖中含有丰富的淀粉、多糖等碳水化合物，为肠道菌群提供了良好的原料基础。实验结果表明，玛咖可降低实验大鼠肓肠总质量，有增加肓肠壁质量和表面积的趋势，其中黑玛咖和紫玛咖作用效果显著（P＜0.05）。粪便含水率增加可增加有毒物质及代谢产物的及时排出体外，减少其在肠道中的停滞时间，维持肠道健康有着重要的作用[22]。研究表明，肠道中双歧杆菌下降，大肠杆菌和梭菌大量繁殖，合造尿总碱合成受阻，产生更多的氨[23]。与空白对照组相比，各实验组均有降低实验大鼠盲肠内容物pH值和游离氨的作用，其中黑玛咖作用显著（P＜0.05）；各实验组均有升高实验大鼠盲肠内容物含水量的趋势，但未达到统计学意义。

SCFA主要包括乙酸、丙酸、丁酸等6个及以下碳原子组成的有机酸，其中乙酸、丙酸和丁酸，约占SCFA总量的90%～95%[24]。SCFA不仅是肠道上皮细胞的主要能量物质，还具有调节机体免疫，减少促炎因子的生成，修复粘膜炎症，改善肠道功能、调节肠道菌群平衡等多种作用。而人体肠道细菌发酵产生SCFA的能力又受肠道菌数量、pH值及底物的影响[25－26]。实验结果表明，玛咖干粉均能增加小鼠肓肠内容物中SCFA的含量，对肠道起一定的保护作用，其中黑玛咖和紫玛咖对实验大鼠肓肠内容物中SCFA的影响显著（P＜0.05）大于黄玛咖和白玛咖。

双歧杆菌作为肠道中重要的生理菌群，能大量合成动物所需的营养物质和维生总碱，对多种肠道病原微生物产生拮抗，增强机体免疫力，调节肠道菌群，抗肿瘤，抗衰老等功能[27－28]。黑玛咖和紫玛咖能显著促进盲肠中双歧杆菌的生长，而抑制肠球菌的生长；各实验组有升高乳酸杆菌和拟杆菌数量的趋势。说明黑玛咖和紫玛咖能促进肠道有益菌的生长，抑制肠道有害菌的生长

4 结论

本次实验结果表明，食用玛咖对机体肠道健康是有益的，其中黑玛咖和紫玛咖对肠道健康的影响效果显著高于黄玛咖和白玛咖。但玛咖粉碎粒度、营养成分、产地及其食用时间对肠道健康的影响及其机理有待深入研究。

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