IL-12家族基因多态性对细胞因子合成及老年重症全身感染预后的影响

李媛莉 赵继波 李福龙 黄树伟 李树铁 汪业铭 滕金亮

(河北北方学院附属第一医院重症医学科，河北 张家口 075000)

全身感染发展过程中起关键作用的细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-12等均存在基因多态性〔1〕。研究发现，全身感染患者中TNFB2发生频率增加，携带该等位基因的患者死亡率明显增加〔2〕。亦有研究表明，IL-12家族中部分等位基因与全身感染发病程度和预后存在明显关联〔3〕；但有关细胞因子基因多态性对全身感染预后的影响机制仍未明确。本次研究通过分析IL-12家族细胞因子基因中IL-12A内含子6区含46 bp的同向重复结构可变数多态性、IL-12B启动子区511位点多态性及IL-12RN内含子2区含86 bp的同向重复结构可变数多态性中不同等位基因对外周血单核细胞IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA表达及血浆细胞因子合成的影响，探讨其与老年重症全身感染预后的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2016年1月至2017年3月河北北方学院附属第一医院收治的老年重症全身感染患者48例为研究组，其中男31例，女17例，年龄62～81岁，平均(69.45±7.60)岁。选取同期在医院体检的健康老年志愿者50人为对照组，其中男29人，女21人，年龄60～73岁，平均(66.13±4.28)岁。本研究经医院伦理委员会同意，受试者均签署知情同意书。

1.2IL-12家族基因多态性分析 使用盐析法从两组受试者外周血白细胞中提取基因组DNA，PCR扩增目的片段，引物序列分别为：①IL-12A(内含子6，VNTR)上游：5'-CGGAGATCTG AGTATCTTGAATCAG-3'；下游：5'-CACTCCAGTCCGGTAACGTGAC-3'。②IL-12B(内含子6，VNTR)上游：5'-CGGAGATCTGAGTATCTTGAATCAG-3'；下游：5'-CACTCCAGTCCGGTAACGTGAC-3'。③IL-12RN(内含子2，VNTR)上游：5'-GAGTCGTTGTGAGGATA-3'；下游：5'-AGGACCAGA-CGTCCATT-3'。反应条件为：98℃ 2 min、96℃ 1 min、40℃ 1 min，72℃ 2 min，共40个循环，74℃延伸5 min。扩增产物经限制性内切酶消化后行琼脂糖凝胶电泳分离目标条带。

1.3外周血单核细胞分离与培养 取对照组外周血20 ml，抗凝处理后2 000 r/min离心，收集血浆。Ficoll一步法分离单核细胞和白细胞，取白细胞层行IL-12家族基因多态性分析；取单核细胞层分离并培养外周血单核细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，显微镜下调整细胞浓度至1×106/L，均匀接种到6孔板中，2 ml/孔，37℃ 5%CO2的培养箱中孵育24 h，取出培养板，向其中3孔加入终浓度为1 μg/ml的脂多糖，另外3孔加入等体积的生理盐水为空白对照，继续培养6 h，收集细胞和培养液上清，-20℃保存待测。

1.4细胞因子mRNA半定量分析 使用SV总RNA纯化系统提取外周血单核细胞总RNA；RT-PCR检测细胞因子表达，引物序列为IL-12α上游：5'-CAGAGACTTAGTCTTTAGGAAGATAG-3'；下游：5'-GTACAGTTTAAAGTGACGAAGTAGG-3'。IL-12β上游：5'-CAGAGACTTAGTCTTTAGGAAGATAG-3'；下游：5'-GTACAGTTTAAAGTGACGAAGTAGG-3'。IL-12ra上游：5'-CCGGAGGCGTCAGTGGATTAGTGAGA-3'；下游：5'-ATGATGAGCAGGAGGACCTTCATCTT-3'。反应条件为：95℃ 5 min、95℃ 1 min、40℃ 1 min，72℃ 2 min，共35个循环，74℃延伸5 min。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，以β-actin为内参计算目标条带的相对表达量。

1.5细胞因子浓度检测和预后观察 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测研究组和对照组受试者血浆中IL-12α、IL-12β、IL-12ra浓度，检测试剂盒购于上海康朗生物科技有限公司，操作严格按试剂盒说明进行。对研究组进行为期3个月的随访，记录住院及随访期间存活或死亡情况。

1.6统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验和χ2检验。

2 结 果

2.1IL-12家族基因多态性分布情况 因IL-12A、IL-12B、IL-12RN等位基因3和4的发生频率极低，因此本研究未对其进行探索。研究组患者携带等位基因IL-12A1、IL-12A2、IL-12B1、IL-12B2、IL-12RN1频率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；研究组患者携带IL-12RN2频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2脂多糖刺激外周血单核细胞后细胞因子等位基因表达情况 对照组外周血单核细胞经脂多糖刺激后，细胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA相对表达量均明显高于生理盐水处理组，差异有统计学意义(P<0.05)；脂多糖刺激组IL-12A和IL-12B各等位基因mRNA相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)；等位基因IL-12RN2相对表达量明显高于IL-12RN1，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3IL-12家族基因多态性对老年重症全身感染预后的影响 研究组患者中IL-12α、IL-12β、IL-12ra细胞因子各自2号等位基因携带者的死亡率均明显高于1号等位基因，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

2.4等位基因对两组受试者血浆细胞因子浓度的影响 研究组各等位基因携带者血浆IL-12α、IL-12β、IL-12ra浓度均明显高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.01)；IL-12A1与IL-12A2，IL-12B1与IL-12B2等位基因携带者对应的细胞因子血浆浓度之间差异均无统计学意义(均P>0.05)；等位基因IL-12RN2携带者血浆IL-12ra浓度明显高于IL-12RN1携带者，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表1 两组受试者IL-12家族基因多态性分布情况〔n(%)〕

与对照组相比：1)P<0.05

表2 对照组外周血单核细胞中细胞因子各等位基因相对表达量比较

与等位基因1相比：1)P<0.05；与生理盐水组比较：2)P<0.05；表3同

表3 IL-12家族各细胞因子等位基因携带者预后情况比较〔n(%)〕

表4 等位基因对两组受试者血浆细胞因子浓度的影响

与对照组相比：1)P<0.05；与IL-12RN1相比：2)P<0.05

3 讨 论

不同机体对感染的反应性存在明显差异，当感染程度相似时，部分患者全身炎性反应较重，治疗预后理想；而部分患者炎性反应炎症，病情发展迅速，常出现MODS或休克〔4〕。相关研究显示，TNF B等位基因2携带者全身感染的发生风险明显增加，炎症感染者中TNFB2纯合子死亡率明显高于其他基因型者〔5〕。后续研究发现，TNF其他相关基因多态性和IL-12ra基因多态性与全身感染治疗预后明显相关〔6〕。提示细胞因子基因多态性是影响机体对感染反应程度的主要因素之一。IL-12家族细胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra在全身炎症反应和平衡方面具有重要调控作用；其细胞因子相关基因内含子和启动子存在基因多态性〔7〕。动物实验显示，部分等位基因对基因转录和蛋白质合成具有调控作用〔8〕。IL-12家族细胞因子基因多态性在调控老年人对炎性刺激的反应性方面仍待阐明。本次研究显示，老年重症全身感染患者中等位基因IL-12RN2的携带率明显增加且死亡率明显升高。体外细胞学研究发现，等位基因IL-12RN2携带者外周血单核细胞受脂多糖刺激后，细胞因子IL-12ra合成量明显高于IL-12RN1携带者。IL-12ra是体内重要抗炎细胞因子，可对抗促炎细胞因子IL-1α、IL-1β的生物活性并调节体内促炎/抗炎平衡。当IL-12ra分泌过多时会过度增强体内抗炎反应，出现代偿性抗炎反应综合征，引发机体免疫麻痹状态。本次研究中携带IL-12RN2等位基因的老年全身感染患者死亡率明显增加与IL-12ra分泌增加有关；老年全身感染患者中IL-12A2、IL-12B2携带者死亡率明显增加，但对应细胞因子的血浆浓度之间无明显差异，可能原因为，上述基因改变对自身编码基因表达水平无明显影响，但对相关的其他基因功能产生影响，进而影响老年全身性感染患者的预后。综上所述，遗传因素是导致老年全身性感染患者炎性反应程度不同的主要原因。在IL-12RN基因多态性中，等位基因IL-12RN2携带者出现全身感染时，体内出现过度免疫抑制的风险较高，引发不良预后。

4 参考文献

1李诗阳,王日兴,吕有凯,等.老年重症感染患者血清降钙素原与C-反应蛋白联合检测的临床价值〔J〕.中国老年学杂志,2016；36(8):1960-1.

2Zhang GL,Xie DY,Ye YN,etal.High level of IL-27 positively correlated with Th17 cells may indicate liver injury in patients infected with HBV〔J〕.Liver Inter,2014;34(2):266-73.

3王 秦,成 凤,张维理,等.重组腺病毒Ad5F35-IL-12感染不同单核-巨噬细胞的研究〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2013;29(2):113-7.

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7段伟利,陈 红.脊柱后路内固定术后切口感染患者红细胞免疫指标分析〔J〕.中国卫生工程学,2017;16(2):238-9,241.

8Joao PP,Daniel GC,Ana RSA,etal.Anti-inflammatory/regulatory cytokine microenvironment mediated by IL-4 and IL-10 coordinates the immune response in hemophilia A patients infected chronically with hepatitis C virus〔J〕.J Med Virol,2013;85(6):1009-18.