超声提取的麦冬多糖聚集行为实验研究

王小梅，金 文，程 磊，车岳鸿，传杨阳，常 柯，郝大鹏

(西安航空学院 a.理学院；b.材料工程学院，西安 710077)

0 引言

麦冬，为百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，又名麦门冬、阔叶麦冬、沿阶草等，其根如连珠节粒，肉质呈纺锤状，入药。麦冬性微寒，味甘微苦，具有养阴生津、润肺止咳、降血糖等功效[1-2]。麦冬多糖是麦冬的主要成分之一，同样具有多种生物活性，如免疫活性、降血糖、抗心肌缺血、耐缺氧能力、抗过敏活性等[3-4]。汤军等[5]研究表明，麦冬多糖能显著增加小鼠的胸腺重量和脾脏重量，激活小鼠网状内皮系统的吞噬功能，并提高血清溶血素抗体水平，进而增强免疫活性。黄琦等[6]对47例2型糖尿病人在利用麦冬多糖治疗前后分别检测空腹血糖、餐前两小时血糖、空腹血浆胰岛素，结果表明，麦冬多糖具有降血糖及稳定血糖的作用，能使周围组织对胰岛素抵抗降低。目前，对麦冬多糖的微观形貌及分子链构象研究较少，而微观形貌和链构象与多糖的生物活性关系密切，因此，对麦冬多糖微观形貌及链构象的研究意义重大。

原子力显微镜(AFM)为人们直接观察生物大分子的微观形貌提供了强有力的方法和手段。利用AFM可以在空气中或者在溶液环境中直接对多糖分子进行观察，制样也比较简单，检测时能尽可能保持多糖分子的生理状态和完整性[7-8]。而且，AFM测定多糖所需时间较短，可以获得多糖样品中大量单分子的统计学信息，目前已经被广泛地应用到蛋白质、多糖等生物大分子的表面形貌和链构象的分析和研究中[9-11]。本文主要利用AFM对超声提取的麦冬多糖的表面形貌、链构象进行观测，获得不同溶液环境中多糖分子链构象，聚集态行为特征等信息，为进一步研究多糖构效关系提供实验依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

麦冬，浙江产，购于西安市万寿路中药市场，Sephadex G-150凝胶，DEAE-cellulose52纤维素，氯化钠、氢氧化钠等均为分析纯试剂，实验用水为双蒸水。

1.2 主要仪器

FD-1A真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器公司)、SPM29500J3型原子力显微镜(日本岛津公司)、系列层析柱2.5×60 cm(上海琪特分析仪器有限公司)、TU1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、TB-215D电子天平(精度：1/105 g，北京赛多利斯仪器系统有限公司)、磁力搅拌器、RE252AA型旋转蒸发器。

2 实验内容与方法

2.1 麦冬多糖的提取

麦冬块根，60 ℃下烘干，粉碎。将200g干燥的麦冬粉末置于1000mL烧杯中，加入4倍体积的95%乙醇，于超声波清洗器中超声脱脂，同时搅拌20min，离心，收集残渣，此脱脂过程重复三次，干燥残渣。利用超声波辅助提取麦冬多糖。超声提取条件：超声 10s，间隔15s，超声次数90次，超声功率为80W，按此提取过程提取两次，将两次的提取液合并，经减压浓缩，用四倍量95%乙醇纯沉，离心，流水透析3天，真空冷冻干燥，得超声提取的麦冬粗多糖，备用。

2.2 麦冬多糖的分离纯化

DEAE-cellulose52色谱柱层析：纤维素阴离子交换剂DEAE-cellulose52经0.5mol/LNaOH 浸泡1h，蒸馏水洗到中性，再用0.5mol/L HCL浸泡1h，蒸馏水洗到中性，再用0.5mol/L NaOH浸泡1h，洗到中性，抽气泡，装柱，用蒸馏水平衡24h。将超声提取的麦冬粗多糖0.5g溶于10mL蒸馏水中，抽滤，滤液注入DEAE-cellulose52色谱柱中，洗脱液为蒸馏水，流速：6s/滴，20min/管，洗脱液用全自动部分收集器收集，利用苯酚-硫酸法在487 nm波长下检测糖含量。绘制DEAE-cellulose52色谱柱洗脱曲线图(以试管数目为横坐标，吸光度值为纵坐标)。合并各主峰溶液并浓缩，蒸馏水透析，冷冻干燥。

Sephadex G-150凝胶色谱柱层析：用适量蒸馏水浸泡Sephadex G-150葡聚糖凝胶，并用沸水煮2h，抽气泡并装柱，用蒸馏水平衡24h。将之前DEAE-cellulose52色谱柱层析收集的组分通过Sephadex G-150葡聚糖凝胶色谱柱分离。流速：4 s/滴，10 min/管。苯酚-硫酸法检测。绘制Sephadex G-150凝胶色谱柱洗脱曲线图(以试管数目为横坐标，吸光度值为纵坐标)。合并各主峰溶液并浓缩，蒸馏水透析，冷冻干燥。

2.3 麦冬多糖原子力显微镜(AFM)观察

样品的制备：将纯化后的麦冬多糖用蒸馏水溶解，配制成1mg/mL的麦冬多糖溶液，在磁力搅拌器下搅拌4 h。将搅拌均匀的麦冬多糖样品用蒸馏水稀释到100ug/mL。再分别配制0.005mol/L的NaOH溶液及0.005mol/L的NaCL溶液，备用。吸取0.25mL 100ug/mL的麦冬多糖溶液，用蒸馏水、0.005mol/L NaOH溶液及0.005mol/L NaCl溶液分别定容到5mL的容量瓶中，得到不同溶液环境中(蒸馏水、0.005mol/L及0.005mol/L NaCl)5ug/mL的麦冬多糖溶液，摇匀，备用。分别取5uL不同溶液环境中5ug/mL麦冬多糖，滴到新剥离的云母片上，在室温、大气下自然风干。

AFM观测：将风干的待测样品分别置于原子力显微镜下测试，图像均在Contact模式下获得，探针为Si3N4，探针的微悬臂长为200 μm，弹性系数为0.28 N/m，利用原子力显微镜附带的软件对AFM图像的形态学特征(如宽度、高度等)进行分析。

3 实验结果与讨论

3.1 紫外吸收及蛋白质检测

将超声提取的麦冬多糖利用紫外可见分光光度计在190～400nm波长范围内进行光谱扫描(见图1)，检测到多糖在260～280nm无吸收峰，说明该多糖样品中不含有蛋白质及核酸。

图1 麦冬多糖的紫外光谱扫描曲线

3.2 分离纯化结果与分析

超声提取的麦冬多糖经DEAE Cellulose-52色谱柱层析分离，用蒸馏水洗脱只得到一个峰(见图2)，将此峰收集，浓缩，注入Sephadex G-150凝胶色谱柱中层析分离，得到一个单一对称峰(见图3)，说明经DEAE Cellulose-52色谱柱层析及Sephadex G-150凝胶色谱层析后得到的麦冬多糖纯度较高。

图2 麦冬多糖的DEAE-cellulose52层析柱色谱图

图3 麦冬多糖的Sephadex G-150凝胶层析柱色谱图

3.3 原子力显微镜观察结果与分析

3.3.1 麦冬多糖在水溶液中的原子力显微镜分析

图4为5ug/mL麦冬多糖在水溶液中的AFM图，从图4中可以看出，麦冬多糖由聚合物长链折叠、缠绕形成，分枝较多。链的高度为1nm左右，链宽约为0.8μm左右，而多糖的分子单链直径的理论值一般为0.1～1.0nm，我们得到的图像宽度远大于多糖单链分子的估计值，这一方面可能是由于针尖在扫描时与分子间相互作用致使多糖链产生增宽效应；另一方面，糖链与带负电的云母表面间范德瓦尔斯相互作用，使多糖分子链聚集平铺在云母表面。糖链通过糖单元间不同的连接方式衍生出许多大小不同的环状结构，尺寸在几百纳米到几个微米不等，说明麦冬多糖具有高度分枝的化学结构。麦冬多糖水溶液AFM图像的结果与van der Waals 相互作用及链间氢键缔合有关[12]。

图4 5ug/mL麦冬多糖的AFM图(溶剂：蒸馏水)

3.3.2 麦冬多糖在NaOH溶液中的原子力显微镜分析

图5 5ug/mL麦冬多糖AFM图(溶剂：0.005mol/L NaOH溶液)

图5为麦冬多糖在0.005mol/L NaOH溶液中的AFM图像，可以观察到麦冬多糖在弱碱环境下形成如麦穗状的多糖刚性链，其多糖分子链的平均高度在10nm左右，而多糖分子链的宽度约为120nm。与图4麦冬多糖在水溶液中的AFM结果不同，这可能是由于弱碱环境下，麦冬多糖分子中的负离子发生了解离，与带负电的云母片产生了更大的互斥效应，使得麦冬多糖分子形成刚性的分子聚合链，使得弱碱环境下麦冬多糖形成刚性分子股。

3.3.3 麦冬多糖在NaCl溶液中的原子力显微镜分析

图6为5ug/mL麦冬多糖在0.005mol/L NaCl溶液中的AFM图像，可以观察到麦冬多糖呈现出树枝状结构及环状结构。麦冬多糖分子链的平均高度在10～30nm，链宽度为0.1～0.8um不等，这是由于在微量的Na+存在的情况下，水溶液中的无序柔性分子转变成为了盐溶液中的刚性分子。与水溶液中麦冬多糖分子链的高度进行比较，结果表明，盐溶液中麦冬多糖单分子链的高度有所增加，其主要原因是由于有盐微粒附着在多糖链上，而且由于Cl-的存在，多糖分子与云母片之间的静电吸附作用减弱，使得更多的麦冬多糖分子链相互缠绕在一起形成更粗的分子股，因此产生了数枝状刚性多糖分子链结构。低视场下，可以更为清晰地观察到麦冬多糖在盐溶液中所呈的结构，其刚性分子的构象更加明显。

4 结语

综上所述，麦冬多糖分子的表面形貌及链构象会因为溶剂环境的不同而变化，分析麦冬多糖在不同溶剂中的AFM图像可知，麦冬多糖在水溶液中由于静电效应，多糖分子呈现柔性链分布在云母表面；在碱溶液中，麦冬多糖的AFM图像与水溶液中不同，由于静电排斥作用比在水溶液中强，使得多糖分子链不能呈现水溶液中的链环状而是麦穗状的刚性多糖分子。5ug/mL麦冬多糖在0.005mol/L NaCl溶液中时，由于静电屏蔽效应，多糖分子呈树枝状或环状结构，分子链的高度也因盐的附着而有所增高，且多糖分子与云母片之间的静电吸附作用减弱，多糖分子相互缠绕高度增加。以上结果均表明，通过改变多糖的溶液环境，可以改变其溶液构象，而多糖的溶液构象与其生物活性关系密切，这为多糖溶液构象及构效关系的研究提供了科学的实验依据和理论支持。

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