阿霉素大鼠肾病综合征模型最佳剂量的筛选

包玉龙，杨 瑞，刘 禾，武晓琳，杜佳林，李显华，夏素霞

(辽宁省中医药研究院，辽宁沈阳 110034)

大鼠阿霉素肾病模型是现今公认的能较好模拟人类肾小球疾病的动物模型，被广泛应用于肾病研究领域中，大量的文献报道了多种造模方法，但是都或多或少存在一些缺陷。因此，我们课题组通过采用尾静脉一次性注射不同剂量的阿霉素，来验证并最终确立适合本课题需要的最佳造模条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体重200 g～240 g，由辽宁长生生物技术有限公司购进，许可证号SCXY(辽)2015-0001。

1.1.2 试验环境 辽宁省中医药研究院实验动物中心，环境合格证SYXK(辽)2012-0003；温度20℃～23℃；湿度50%～60%；饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXY(京)2014-0010。

1.1.3 药物 阿霉素(ADR)注射用干粉，海正辉瑞制药有限公司生产，产品批号16018711,规格10 mg/瓶；注射用水，华仁药业股份有限公司生产，产品批号Q1607026。

1.1.4 仪器 Daytona全自动生化分析仪， 英国朗道RANDOX公司生产；ES-J系列电子分析天平，沈阳龙腾电子称量仪器公司生产。

1.2 方法

取体重200 g～240 g的雄性SD大鼠70只，适应性饲养7 d后放入清洁代谢笼中，收集24 h尿液，检测尿蛋白呈阴性，符合标准，将70只大鼠按体重随机分为4组，A组为空白对照组，B组为阿霉素7.5 mg/kg剂量组，C组为阿霉素6.5 mg/kg剂量组，D组为阿霉素5.5 mg/kg剂量组，A组10只大鼠，B、C、D组各20只大鼠。将阿霉素用注射用水溶解，浓度为2 mg/mL,将鼠尾消毒后，B、C、D组一次性尾静脉注射相应剂量的阿霉素，A组给予相同体积的生理盐水。各组均在造模后第14、28天分别用代谢笼接取24 h尿液测定尿蛋白，用Bradford比色法测定尿蛋白含量，取尿蛋白含量>100 mg/24 h为肾病模型成立[1]，定期称量大鼠体重，采食量、饮水量、尿量；在造模后第2周、第4周经眼静脉丛采血测定肌酐、尿素、血浆白蛋白、血糖。使用SPSS13.0软件进行统计处理试验数据，采用方差分析进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠一般状态的影响

试验期间，空白对照组大鼠食欲旺盛，反应灵敏，体重持续增加。造模大鼠造模前一切正常，造模第4天出现不同程度的腹泻，食欲减退，精神不振，皮毛光泽变差；造模2周有腹水发生，体重明显降低，背毛疏松，蜷缩烦躁，尾巴有坏死脱落现象；第3周出现轻度水肿，以足部、睾丸部较明显，个别大鼠出现门齿松动脱落，后肢行走不便的症状。第4周时造模大鼠消瘦明显、精神状态较差，进入死亡高发期，造模后28 d时，A组没有大鼠死亡， B组共计死亡12只，死亡率60%；C组共计死亡3只，死亡率15%；D组死亡1只，死亡率5%。可见B组死亡大鼠明显多于C组和D组。

2.2 对各组大鼠体重及采食量的影响

与A组相比，造模前各组大鼠的采食量、体重没有差异；造模后B组、C组、D组大鼠的采食量、体重明显降低，而且有逐渐降低的趋势，与A组比较差异显著，有统计学意义(表1)。

2.3 对各组大鼠饮水量、尿量及24 h尿蛋白定量的影响

与A组比较，B组、C组大鼠的饮水量明显减少，与A组比较差异显著，C组大鼠的饮水量与A组比较没有明显差异，但有减少的趋势。与A组比较，B组、C组、D组大鼠的尿量没有明显差异，但有减少的趋势。与A组比较，B组、C组、D组大鼠的24 h尿蛋白定量明显升高，与A组比较差异显著，有统计学意义。同时B组、C组大鼠的24 h尿蛋白定量值都高于100 mg/24 h，达到了肾病模型建立标准；D组大鼠的24 h尿蛋白定量虽然明显高于A组，但其24 h尿蛋白定量值低于100 mg/24 h，未达到肾病模型建立标准(表2)。

表1 造模对各组大鼠体重及采食量的影响

注：与A组比，**P<0.01。

Note:Compared with group A,**P<0.01.

表2 造模对各组大鼠每天饮水量、尿量及尿蛋白含量的影响

注：与A组比，*P<0.05,**P<0.01。

Note:Compared with group A,*P<0.05,**P< 0.01.

2.4 对各组大鼠肌酐、白蛋白及尿素含量的影响

与A组比较，B组、C组、D组大鼠在造模后14 d的肌酐值没有明显差异；造模后28 d时B组、C组大鼠的肌酐值明显升高，与A组比较差异显著，有统计学意义；D组大鼠的肌酐值虽有升高但与A组比较没有显著差异。与A组比较，B组、C组、D组大鼠在造模后14 d的白蛋白值没有明显差异；造模后28 d时B组、C组大鼠的白蛋白值明显升高，与A组比较差异显著，有统计学意义；D组大鼠的白蛋白值虽有升高但与A组比较没有显著差异显著。与A组比较，B组、C组、D组大鼠在造模后14 d、28 d的尿素值没有明显差异(表3)。

表3 造模对各组大鼠肌酐、白蛋白及尿素含量的影响

注：与A组比，*P<0.05。

Note:Compared with group A,*P<0.05.

3 讨论

阿霉素造模原理。阿霉素(ADR)是一种含醌式结构的抗肿瘤药物，ADR在体内药物代谢酶的作用下，形成半醌自由基，半醌自由基与氧化反应生成超氧阴离子和羟自由基，两者可通过膜的脂质过氧化作用，对肾脏造成损伤[2]，从而诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应，破坏滤过膜结构和功能，产生蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症，肾小管和肾小球发生病理变化。孙艳萍等[3]研究发现阿霉素可以损伤肾脏近曲小管，使近曲小管上皮细胞肿胀，扭曲，排列紊乱，部分脱失；粒体和溶酶体囊状扩张，结构模糊，细胞核有不同程度的损伤。除此之外阿霉素副作用还包括心脏、骨髓毒性及胃肠道反应等，因此当使用剂量较大时常可导致模型动物的生存力减弱，而致病死率增加。

造模部位选择。阿霉素属广谱抗肿瘤抗生素，是一种高效发泡剂，当发生血管外渗时，可导致局部组织出现化学性损伤，因鼠尾离躯干较远，采用尾静脉注射即便出现了渗漏也不会引起躯干组织的大面积损伤[4]，因此目前试验中采用尾静脉注射方式比较多。

造模方式选择。周桥等[5-6]在保留双肾的情况下采用尾静脉低剂量多次注射给药，这样死亡率虽然低，但造模周期较长，反复尾静脉注射极易造成阿霉素渗出而引起局部坏死、感染。采用单侧肾切除后一次或多次给予阿霉素造模，该方法与保留双肾的建模方法相比，阿霉素剂量小，减轻了阿霉素的毒副作用，但对试验条件要求比较高，手术难度大，试验大鼠感染病死率相对较高，试验周期相对较长[7-9]。采用尾静脉一次性注射造模，具有操作简单，无需手术，成模较快等优点；缺点是因考虑阿霉素组织毒性较强，一次性给药剂量较大易引起试验动物死亡，而剂量小时又难以成模，所以一次性造模成败的关键因素是合适剂量的选择。

综上所述，我们认为采用尾静脉一次性注射造模方法比较简便高效，试验中D组大鼠的24 h尿蛋白定量值低于100 mg/24 h，未达到肾病模型建立标准；B组、C组大鼠的24 h尿蛋白定量值都高于100 mg/24 h，达到了肾病模型建立标准；但是B组大鼠的死亡率高达60%，C组大鼠的死亡率为15%，所以从大鼠的死亡率、尿蛋白含量、精神状态等综合比较，C组模型实用性更强。通过试验最终确立尾静脉一次性注射阿霉素6.5 mg/kg剂量为最佳造模条件。

参考文献：

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[2] 魏 伟，吴希美，李元建.药理实验方法学[M].4版，北京：人民卫生出版社，2010.

[3] 孙艳萍,陈金和,陈贤钧.丹参对大鼠肾脏近曲小管超微结构保护机制的研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2003,4(3):145-147.

[4] 杜 宇，魏 红，李海涛.阿霉素大鼠肾病模型的概述[J].中国医药指南，2013，11(9)：78-79.

[5] 周 桥,卢 颖,仲 芳,等.蛋白酶体抑制剂硼替佐米对阿霉素肾病大鼠肾脏的保护作用[J].上海交通大学学报(医学版),2011,31(2):158-164.

[6] Lebrecht D，Setzer B，Rohrbaeh R，et al．Mitockmdrial DNA and its respiratory chain products are defective in doxorubicin nephrosis[J]．Nephrol Dial Transplant，2004，19(2)：329-336．

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[9] 赵宗江,刘 昆 ,杨美娟,等.三七总皂甙对阿霉素肾病大鼠肾组织ET1蛋白及m R NA 表达的影响[J].北京中医药大学学报,2007,30(4):226-22.