淫羊藿素对BALB/c-nu裸鼠前列腺癌组织磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路及E-钙黏蛋白的影响*

饶 红 武福云 陈德森△

（1.湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000）

淫羊藿又称仙灵脾，为小檗科淫羊藿属植物，药用其全草，其味辛、甘、性温，归肝肾经［1］。淫羊藿具有补肾壮阳、强健筋骨、祛风除湿之功效［2］。本研究中所用淫羊藿素是淫羊藿全草经现代工艺提取的生物碱。现代药理学研究表明，淫羊藿素具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、调节疫力、促进间充质干细胞增殖及迁移等药理作用［3-4］。前列腺癌属前列腺的恶性肿瘤，由前列腺腺泡细胞基因突变引发腺泡细胞异常生长并最终导致癌变，前列腺癌以中老年男性为高危人群，占癌症死亡的第2位，因此，积极防治前列腺癌对提高男性生命健康具有重要意义。研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路在抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖方面具有重要作用，与前列腺癌的发生发展密切相关，而钙黏蛋白E（E-cadherin）在 PI3K/Akt信号通路活化中发挥关键作用，E-cadherin低表达提示肿瘤细胞周期发生改变，此时肿瘤细胞侵袭和转移能力增强［5-6］。很多中药及其单体在体外实验中具有降低细胞侵袭能力和转移作用，如在对中药淫羊藿的单体淫羊藿素的研究中，有研究发现其在细胞培养中对LNCaP细胞前列腺癌细胞周期具有明显的抑制作用［7-8］。但针对活体实验却鲜有研究，本实验主要通过观察淫羊藿素对雄激素依赖型前列腺癌模型小鼠前列腺癌组织PI3K/Akt信号通路及E-cadherin的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

雄性 BALB/c-nu裸鼠，SPF 级，40只，4～6周龄，体质量20.5～21.5 g，随机均分为空白对照组、荷瘤组、LY294002组和淫羊藿素组，每组10只。动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK（鄂）2017-0031。实验中将单只裸鼠置于隔离器中，用无特定病原体条件饲料饲养，室温为26～28℃，相对温度应保持在40～60%，维持10 h光照，14 h无光的明暗周期。裸鼠采用脱臼法处死，本实验方法经十堰市太和医院医学实验动物管理委员会批准

1.2 试药与仪器

人LNCaP前列腺癌细胞株购自尔顿生物科技（上海）有限公司；淫羊藿素标准品购自成都瑞芬思生物科技有限公司；C4H10O（乙醚）购自洛阳昊华化学试剂有限公司；胎牛血清（FBS）由赛默飞公司提供；RPMI-1640细胞培养基及EDTA购自上海冠导生物工程有限公司；磷酸化雄激素受体AR（p-AR）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、雄激素受体剪接变异体（AR-V7）、降钙素（Calcitonin）和E-cadherin检测用试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司提供。宝特ELX-808IU多功能酶标仪，上海拜格生物科技发展有限公司。

1.3 雄激素依赖型前列腺癌模型制备

将人LNCaP前列腺癌细胞株速融、解冻，在RPMI-1640培养液中复苏，24 h后倒入RPMI-1640培养液培养，3 d后用0.25%EDTA消化，收集培养好的人LNCaP前列腺癌细胞株并用RPMI-1640培养液调制成2×107个/mL的细胞悬液备用。造模时参考王金秋［9］的手术方法，将荷瘤组、LY294002组和淫羊藿素组BALB/c-nu裸鼠移出隔离柜，乙醚吸入麻醉，仰卧位固定小鼠四肢及头部，碘伏消毒下腹部，从裸鼠髂前上棘正中腹白线切开腹部皮肤、钝性分离裸鼠腹膜、找到膀胱，将膀胱推向尾端、翻转以暴露裸鼠生殖腺，用棉签将生殖腺向左右腹壁推，暴露左右叶前列腺，裸鼠前列腺与周围组织不同，颜色较周围组织深，呈叶状肉红色。用微量注射器抽取50 μL备用的人LNCaP前列腺癌细胞株，左右叶前列腺腺体各注射25 μL，以前列腺叶包膜向上轻微鼓起为准。注射完成后还纳腹部组织器官，关闭腹腔、分层依次缝合腹膜、肌层及皮肤，碘伏消毒手术区皮肤即可。空白对照组仅碘伏消毒手术区皮肤，不再做其他处理。

1.4 干预方法

注射造模2周后，淫羊藿素组按80 mg/kg剂量尾静脉注射淫羊藿素，LY294002组尾静脉注射P13K/Akt抑制剂LY294002，空白对照组、荷瘤组尾静脉注射等体积生理盐水。以上治疗每天1次，共治疗4周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 取材及标本制作 于治疗结束后脱臼法处死各组小鼠，仔细摘取小鼠前列腺，取20 mg前列腺瘤组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，用显微镜下标记，用组织芯片制备仪制备前列腺瘤组织芯片标本，然后编号冻存备用。另取20 mg组织用4℃PBS冲洗血迹，离心管加700 μL预冷4℃的PBS液，剪碎前列腺瘤组织，冲打、混匀，放入离心管，重复3次吸弃PBS液；匀浆10 min，4℃条件12000 r/min离心30 min；弃上层液、取中层液到标记好的样品管中，-80℃低温冻存备用。

1.5.2 Western blotting检测 采用Western blotting检测p-AR、p-Akt蛋白表达。取上述冻存备用的前列腺瘤组织匀浆液，样品孔加50μg蛋白液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转到硝酸纤维膜，用5%脱脂奶粉封闭，加一抗 p-AR、p-Akt和 GAPDH（内参），4 ℃孵育过夜，TBST液洗涤，加二抗摇床孵育60 min（室温下），然后用TBST液洗涤（7 min），滴加ECL发光液避光反应5 min，然后曝光显影，以GAPDH为内参，Image J软件分析目标条带的相对表达量（光密度值）。

1.5.3 免疫荧光双重染色 采用免疫荧光双重染色法（FITC-CY3）检测前列腺瘤组织芯片标本中E-cadheri、AR-V7和Calctionin阳性表达率。将编号冻存的前列腺瘤组织芯片标本连续切片（4 μm），58℃烘烤18 h，常规脱蜡后用PBS液冲洗3遍。柠檬酸缓冲液抗原修复20 min，室温冷却20 min用PBS液冲洗3遍。滴加蛋清（20%）后于室温下静置30 min，再用PBS液冲洗3遍。滴加10%正常羊血后于室温下温静置20 min。加鼠E-cadheri、AR-V7和Calctionin一抗混合物，室温下孵育4 h，用PBS液冲洗3遍，封片，LeicaTCS SP2共聚焦显微镜（德国LEICA公司）下激光扫描，以E-cadherin细胞核内可见红色荧光为阳性表达，AR-V7和Calctionin以胞核内棕黄色颗粒为阳性表达，计算机采集数据后记录其阳性表达率。

1.6 统计学处理

应用SPSS11.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组p-Akt和p-AR相对表达量比较

见表1。荷瘤组前列腺组织p-Akt和p-AR均高表达，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。LY294002组和淫羊藿素组前列腺组织p-Akt和p-AR均低表达，与荷瘤组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。淫羊藿素组与LY294002组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组E-cadheri、AR-V7和Calctionin阳性率比较

见表2。荷瘤组前列腺组织芯片标本中AR-V7和Calctionin阳性率明显升高，E-cadherin阳性率明显降低，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。淫羊藿素组AR-V7和Calctionin阳性率明显降低，E-cadherin阳性率明显升高，与荷瘤组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。LY294002组和淫羊藿素组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组p-AR、p-Akt相对表达量比较（±s）

表1 各组p-AR、p-Akt相对表达量比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与荷瘤组比较，△P＜0.05。下同。

组别 n p-AR p-Akt空白对照组 40 0.67±0.05 0.90±0.10荷瘤组 40 3.21±0.19* 1.94±0.12*LY294002 组 40 0.43±0.02△ 0.65±0.09△淫羊藿素组 40 0.48±0.05△ 0.69±0.04△

表2 各组 E-cadheri、AR-V7和 Calctionin阳性率比较（%，±s）

表2 各组 E-cadheri、AR-V7和 Calctionin阳性率比较（%，±s）

组 别 n Calctionin E-cadheri AR-V7空白对照组 40 31.49±4.07荷瘤组 40 46.31±5.01*LY294002 组 40 30.29±1.92△82.82±7.21 19.41±2.29 22.93±1.96* 32.45±2.15*88.34±7.83△ 18.76±3.20△淫羊藿素组 40 29.76±2.74△86.27±6.75△ 17.02±1.23△

3 讨 论

P13K/Akt信号通路广泛存在于真核细胞内，作为介导细胞存活的经典信号通路之一，在机体生理功能中，对正常的细胞生长、存活起关键作用，并在抑制细胞凋亡、促进细胞增殖等方面也发挥重要作用，尤其与前列腺癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌及卵巢癌等的发生、发展密切相关［10］。大量研究表明，在基因变异、细胞缺氧或雄激素受体（AR）表达增加均可激活PI3K/Akt信号通路。PI3K/Akt信号通路被激活后会促使AR和Akt磷酸化生成p-AR和p-Akt，后者通过诱导抗凋亡蛋白表达和磷酸化凋亡调节蛋白产生抑制细胞凋亡作用［11］。近期有研究表明，PI3K/Akt信号通路通路抑制剂LY294002和血管内皮生长因子抑制剂能有效抑制肿瘤血管形成和肿瘤细胞生长［12］。AR-V7为AR的剪接变异体之一，在前列腺癌组织中，雄激素通过激活AR并使之进入胞核来发挥生物学作用，但AR-V7在胞核中并不依赖雄激素，AR-V7处于持续激活状态，因此，AR-V7高表达常预示患者复发及生存时间缩短［13］。E-cadherin在前列腺癌发展中发挥关键作用，E-cadherin属于经典的钙黏附蛋白，E-cadherin高表达可增强肿瘤细胞与间质细胞黏附力，抑制肿瘤细胞浸润和转移［14］。神经内分泌细胞（NE细胞）存在于正常前列腺组织，NE细胞可分泌Calctionin，研究发现，NE细胞在前列腺癌的进展过程中表现活跃，免疫学检测常见Calctionin分泌增加，Calctionin过表达会促使原发性前列腺癌发生去势抵抗现象并增加肿瘤浸润和转移风险［15］。研究表明，蛋白激酶B主要分布于细胞内核、线粒体、微粒体和胞液中，在细胞存活和凋亡中起重要作用，因激酶被证明是反转录病毒安基因v-akt的编码产物，故又称 Akt［16］。AR为属性激素受体，作为核内转录因子，在正常情况下与雄激素结合并激活下游靶基因以维持前列腺干祖细胞的正常分化［17］。当PI3K/Akt信号通路被激活后会促使其乙酰化（即p-AR和p-Akt），p-AR可促进AR的核转移从而导致肿瘤细胞分化和转移，而p-Akt转录活性增强可诱导抗凋亡蛋白表达和磷酸化凋亡调节蛋白产生抑制细胞凋亡作用。本研究通过不同方法检测前列腺组织p-Akt、p-AR、AR-V7、E-cadherin和Calctionin等指标来分析淫羊藿素对P13K/Akt信号通路的影响机制。在本实验中，荷瘤组前列腺组织p-Akt和p-AR均高表达，前列腺瘤组织芯片标本中AR-V7和Calctionin阳性率明显降低，E-cadherin阳性率明显升高，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示前列腺瘤组织PI3K/Akt信号通路激活，促使AR和Akt磷酸化生成p-Akt和p-AR，后者通过诱导抗凋亡蛋白表达和磷酸化凋亡调节蛋白产生抑制细胞凋亡作用。LY294002为PI3K/Akt信号通路抑制剂，可以阻断PBK/Akt信号通路，对前列腺癌细胞的侵袭、转移能力有明显的抑制作用［18］。在本实验中，与荷瘤组比，淫羊藿素组前列腺组织p-Akt和p-AR低表达，AR-V7和Calctionin阳性率明显降低，E-cadherin阳性率明显升高。而LY294002组和淫羊藿素组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。这说明淫羊藿素有与LY294002相同的作用，对PI3K/Akt信号通路也具有明显的抑制作用，且作用的靶点与LY294002相同。淫羊藿素可阻止AR和Akt磷酸化生成反应，经淫羊藿素治疗后p-Akt和p-AR均低表达。在临床上，AR-V7常作为患者预后评估的重要参考信息，其检出率增高常表明肿瘤复发、转移、去势抵抗及生存时间缩短。E-cadherin蛋白属钙依赖性黏附蛋白，主要分布在上皮细胞膜黏附区，在正常上皮组织上高表达，主要介导细胞与基质之间的连接，调控肿瘤细胞的侵袭及转移［19］。淫羊藿素组E-cadherin阳性率提高，这可增加肿瘤细胞与基质之间的黏附力，阻止原发性肿瘤细胞脱落而降低其转移。另一方面，淫羊藿素还可抑制AR乙酰化（AR-V7阳性率降低）而发挥抑制肿瘤细胞生长和转移。淫羊藿素在前列腺癌的进展过程中也发挥了抑制作用，淫羊藿素可能在一定程度了降低了前列腺组织中神经内分泌细胞（NE细胞）活性，使Calctionin分泌减少，这也在一定程度了降低了原发性前列腺癌发生去势抵抗现象和转移的可能。

综上所述，淫羊藿素具有调控PI3K/Akt信号通路的作用，主要通过调控p-Akt、p-AR、AR-V7和Calctionin水平而影响前列腺癌LNCaP细胞侵袭和转移。在这一过程中，淫羊藿素可阻止AR和Akt磷酸化生成反应来实现抑制肿瘤生长的作用，并通过提高E-cadherin来增加肿瘤细胞与基质之间的黏附力，降低Calctionin分泌，从而阻止原发性肿瘤细胞脱落而降低其转移［20］。这一实验结果也提示PI3K/Akt信号通路可抑制E-cadherin和pAkt等因子转录，这为后期开发淫羊藿素应用于治疗列腺癌提供了一定的理论依据。

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