基于快速液相色谱技术对祛浊通痹复方质量控制的研究*

谢志军 严瑶琦 苗丽丽 邵 丰 孙 静 李海昌 温成平△

（1.浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第二医院，浙江杭州 310005）

祛浊通痹复方是本课题组承担的国家科技部 “十一五”支撑项目“血液免疫科常见病的中医临床治疗研究”中的基本方剂。临床研究表明本方对间歇期痛风具有较强的抑制尿酸生成和促进排泄作用，长期使用未见明显不良反应。其处方主要由土茯苓、萆薢、姜黄、桑寄生等组成［1］。方中土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，其味甘、淡，性平，据《本草纲目》记载，能“健脾胃，强筋骨，祛风湿，利关节，止泄泻”。现代药理研究发现其含落新妇苷、异黄杞苷、胡萝卜苷、鞣质、树脂己糖、淀粉、琥珀酸、棕榈酸、白藜芦醇、菝葜皂苷类等成分［2］，其所含落新妇苷具有镇痛、利尿、抗菌、抗癌、解毒等药理作用［3-5］；萆薢出自《神农本草经》，性味苦、平，归肝、胃、膀胱经，现代药理研究发现其主要含有甾体皂苷、二芳基庚烷类及木脂素类等成分，能祛风湿、利湿浊，其所含薯蓣皂苷元有消炎、抗菌、抗癌以及降血脂等多种作用［6-7］，其乙醇提取物能上调动物肾脏中尿酸转运相关基因和蛋白的表达［8］；姜黄出自《唐本草》，性温，味苦、辛，能破血行气，通经止痛，主含姜黄素、去甲氧基姜黄素、去二甲氧基姜黄素等成分，现代药理研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗血管粥样硬化等药理作用［9-11］；桑寄生源于《神农本草经》，味苦、甘，性平，归肝、肾经，能祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎等，现代药理研究表明，桑寄生有降压、抗病毒等作用，对中枢神经系统有一定镇静作用，其主要成分槲皮素具有免疫增强、镇痛、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等药理作用［12-14］。以上提示：落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素等可能是本方的主要有效成分，因此选择此4种成分作为本复方质控的主要成分。

快速液相色谱法（RPLC）是近年来发展起来的一种全新的液相色谱方法，与传统的高效液相色谱法相比具有分离时间短，分离效率、灵敏度以及分辨率高，试剂消耗量少等特点［15］。因此，本研究采用RPLC测定祛浊通痹复方中落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素等的含量。

1 仪器与试剂

Agilent Technologies 1290 infinity快速液相色谱仪，Sartorius电子分析天平，SK5210LHC超声清洗仪。落新妇苷标准品（A0102）由上海宝曼生物科技有限公司提供，薯蓣皂苷元标准品（110773-200911）、槲皮素标准品（110731-201011）、姜黄素标准品（110728-200941）均由中国药品生物制品检定所提供。祛浊通痹复方（批号：101128，101130，101201）及阴性复方均由浙江中医药大学饮片厂提供。甲醇、乙腈为色谱纯，水为去离子双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 1）落新妇苷。液相色谱柱为Eclipse Plus C18，流动相为甲醇∶水∶冰醋酸＝30∶70∶0.2，进样量1 μL，流速 0.2 mL/min，柱温 25 ℃，DAD 检测器：检测波长290 nm。2）薯蓣皂苷元。液相色谱柱为Eclipse Plus C18 柱，流动相为乙腈-水（90∶10），流速 0.2 mL/min，柱温35℃，DAD检测器：检测波长210 nm。3）姜黄素。液相色谱柱为Eclipse Plus C18，流动相为乙腈-4%冰醋酸溶液（48∶52），流速 0.2 mL/min，柱温 25 ℃，DAD检测器：检测波长430 nm。4）槲皮素。液相色谱柱为Eclipse Plus C18，以甲醇-0.4%磷酸（50∶50）为流动相；流速0.2 mL/min，柱温25℃，DAD检测器：检测波长为360 nm。

2.2 供试品溶液的制备 1）落新妇苷和姜黄素供试品溶液的制备。取祛浊通痹复方粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量。超声提取30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足丢失的质量，摇匀，经0.22 μm滤膜过滤，滤液即为供试液。2）薯蓣皂苷元供试品溶液的制备。取祛浊通痹复方粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量。超声提取30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足丢失的质量，过滤。滤液中加入2 mol/L的盐酸25 mL，加热回流1 h，放冷后，用石油醚（60～90℃）30 mL萃取 3次，合并石油醚层，挥干石油醚后，残渣用25 mL乙腈溶解即得。3）槲皮素供试品溶液的制备。取祛浊通痹复方粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量。超声提取30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足丢失的质量，过滤。滤液中加入2 mol/L的盐酸25 mL，加热回流1 h，放冷后，用乙酸乙酯30 mL萃取2次，合并乙酸乙酯层，挥干乙酸乙酯后，残渣用25 mL甲醇溶解即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥过夜的落新妇苷、槲皮素、姜黄素的对照品适量，用甲醇溶解，分别配成质量浓度为0.105、0.0625、0.021 mg/mL的对照品溶液；精密称取经五氧化二磷干燥过夜的薯蓣皂苷元对照品适量，用乙腈溶解，配成质量浓度为0.0637 mg/mL的对照品溶液。

2.4 阴性对照品溶液的制备 制备方法均参照“2.2”项。1）落新妇苷阴性对照品溶液的制备。取不含土茯苓的“复方”粉末2 g。2）姜黄素阴性对照品溶液的制备。取不含姜黄的“复方”粉末2 g。3）槲皮素阴性对照液的制备。取不含桑寄生的“复方”粉末2 g。因复方中的姜黄也含有薯蓣皂苷元，因此萆薢的阴性复方按“2.2”项下方法制备后，也会发生酸水解产生薯蓣皂苷元，故不设薯蓣皂苷元的阴性实验。

2.5 落新妇苷专属性考察 将落新妇苷对照品溶液、祛浊通痹复方供试品溶液、土茯苓阴性复方溶液，放入快速液相色谱仪中，依次进样，进样量为1 μL。供试品溶液图谱与对照品溶液图谱相同保留时间处有同样色谱峰，色谱峰分离度良好，基线稳定，整个分析在20 min内完成，阴性样品无干扰。结果见图1。

图1 土茯苓RPLC图

2.6 薯蓣皂苷元专属性考察 将薯蓣皂苷元对照品溶液、祛浊通痹复方供试品溶液、萆薢阴性复方溶液，放入快速液相色谱仪中，依次进样，进样量为1 μL。供试品溶液图谱与对照品溶液图谱相同保留时间处有同样色谱峰，色谱峰分离度良好，基线稳定，整个分析在10 min内完成。见图2。

图2 萆薢RPLC图

2.7 槲皮素专属性考察 将槲皮素对照品溶液、祛浊通痹复方供试品溶液、桑寄生阴性复方溶液，放入快速液相色谱仪中，依次进样，进样量为1 μL。供试品溶液图谱与对照品溶液图谱相同保留时间处有同样色谱峰，色谱峰分离度良好，基线稳定，整个分析在15 min内完成，阴性样品无干扰。见图3。

图3 桑寄生RPLC图

2.8 姜黄素专属性考察 将姜黄素对照品溶液、祛浊通痹复方供试品溶液、姜黄阴性复方溶液，放入快速液相色谱仪中，依次进样，进样量为1 μL。供试品溶液图谱与对照品溶液图谱相同保留时间处有同样色谱峰，色谱峰分离度良好，基线稳定，整个分析在10 min内完成，阴性样品无干扰。见图4。

图4 姜黄素RPLC图

2.9 线性关系考察 取“2.3”中配置好的对照品溶液，依次进样 1、2、3、4、5 μL，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行线性回归。得4种成分的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表1。

表1 标准曲线的回归方程

2.10 精密度试验 取“2.2”项中制备好的各供试品溶液，进样1 μL，重复5次，以峰面积计算RSD值。结果落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素的RSD分别为1.55%、0.66%、0.33%、1.53%。

2.11 重复性试验 取同一批号（101130）的复方各5份，按照“2.2”项下制备各供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素的RSD分别为1.79%、3.36%、1.67%、2.24%。

2.12 稳定性试验 取“2.2”中制备好的各供试品溶液，在 0、2、4、8、10、12、14、16 h 分别进样 1 μL，结果落新妇苷在16 h内稳定，薯蓣皂苷元和姜黄素在12 h内稳定，槲皮素在8 h内稳定，落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素和槲皮素的RSD分别为1.47%、2.91%、2.87%、2.41%。

2.13 加样回收试验 取批号为101130的复方各5份，分别加入落新妇苷0.105 mg、薯蓣皂苷元0.255 mg、姜黄素0.21mg、槲皮素0.19 mg，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，重复5次，结果落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素的平均加样回收率分别为101.29%、97.35%、101.97%、99.18%，RSD分别为2.76%、2.41%、2.78%、2.71%。

2.14 含量测定 取批号分别为 101128、101130、101201的3批复方，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，结果见表2。

表2 祛浊通痹复方中落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素的测定

3 讨 论

3.1 色谱条件的选择 1）落新妇苷。流动相的选择曾使用过甲醇-水-冰醋酸溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等进行等度及梯度洗脱，由于干扰峰因素，以及保留时间、峰型、拖尾等因素的影响，最后根据分离情况，采取了甲醇∶水∶冰醋酸=30∶70∶0.2 作为流动相进行等度洗脱，在此条件下，落新妇苷的峰型及分离度均较好，能为复方中落新妇苷的定性、定量分析提供较好的RPLC条件。2）薯蓣皂苷元。色谱条件曾采用过甲醇-水，室温下进行、乙腈-水不同比例，室温或者35℃等多种条件进行等度及梯度洗脱，由于干扰峰因素，以及保留时间、峰型、拖尾等因素的影响，最后根据分离情况，采取了乙腈-水=90∶10，35℃进行梯度洗脱。在此条件下，薯蓣皂苷元能得到很好的分离。3）姜黄素。检测姜黄素时，色谱条件按《中国药典》05版中规定的方法进行，峰型和分离度都比较好，理论塔板数≥4000。4）槲皮素。单味桑寄生药材中，槲皮素在流动相为甲醇-0.4%磷酸=35∶65时，可以得到较好的分离，而在复方中，在上述条件下，槲皮素的峰型、分离度不是很好。多次改变流动相比例后发现，甲醇-0.4%磷酸=50∶50时，槲皮素可以得到较好的分离。

3.2 复方中有效成分的选择 由于复方所含成分太多，且复方是各单味药共同起作用，与单味药的作用机理有些不同，因此复方的有效成分很难确定。祛浊通痹复方主要用于治疗间歇期痛风，而间歇期痛风常见肝郁脾虚、浊瘀内阻之证。治宜疏肝运脾、泄浊祛瘀为主。结合祛浊通痹复方的临床应用目的以及间歇期痛风的病因、病机特点，因此选择了落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素4种成分作为复方的主要有效成分测定。RPLC法测定祛浊通痹复方中落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素、槲皮素的含量，可以更好的排除复方中其他成分的干扰，各成分峰能得到较好的分离，直接采用峰面积定量，方法简单，重现性好。因此，本方法可用于祛浊通痹复方中落新妇苷、薯蓣皂苷元、姜黄素和槲皮素含量的测定，为其质量标准提供依据。

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