调脂颗粒干预血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞自噬水平的实验研究*

陈 超 赵笑东 张国兴 尹学敏 陈竞纬△

（1.上海中医药大学，上海 200120；2.江苏省苏州市中医医院，江苏 苏州 215009；3.苏州大学，江苏 苏州 215009）

血管内皮细胞在维持正常的血管功能方面发挥着重要作用，多种因素致血管内皮损伤是动脉粥样硬化（As）发生和发展的始动环节［1］。肾素-血管紧张素系统是体内重要的体液调节系统，参与维持心血管功能稳态。有研究表明高浓度血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）会破坏血管内皮细胞的屏障功能，抑制血管舒张和收缩，参与As 的进程［2-3］。 范俊等研究者［4-5］进一步发现 AngⅡ刺激内皮细胞后，血管内皮的变化与AngⅡ诱导的细胞自噬有关。在As的发病过程中，一定程度的自噬能促进斑块稳定，而过量自噬则可能导致细胞死亡，促进As发生发展［6］。吴门调脂颗粒是由蒲黄、姜黄、泽泻3味中药按照一定比例配伍提取而成，临床疗效颇丰。前期的临床及实验室研究表明调脂颗粒能加快脂质的代谢和转运［7-9］。笔者最新研究还发现调脂颗粒对细胞自噬起到双向调节作用［10］。因此本研究旨在阐明调脂颗粒在AngⅡ诱导细胞自噬中的作用，从而探讨调脂颗粒在抗As中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由苏州大学血液研究所提供）。40只SD大鼠，雌雄各半，体质量（200±10） g，无特定病原体（SPF）级，由苏州大学医学部实验动物中心提供，许可证号：SYXK（苏）2017-0043。饲养条件如下：5 只 1笼，温度（25±2） ℃，湿度50%～60%，通风良好，自由摄食饮水，勤换垫料。

1.2 试药与仪器 调脂颗粒购自苏州市中医医院，批号：150915；DMEM 培养基购自 Gibco公司，批号：22016004；胎牛血清购自普飞生物公司，批号：1A2375；LC3B抗体（免疫荧光）购自 Novus公司，批号：32011；beclin-1抗体购自Abcam公司，批号：GR261694-5；P62抗体购自CST公司，批号：NO005；胰酶细胞消化液，批号：C0201；裂解液（中），批号：P0013C；DMSO，批号：s7038；MTT试剂盒，批号：C0009；AngⅡ，批号：SLBF7813V；明胶，批号：G8060；LC3B 抗体（Western blot），批号：046M4787V，均购自 Sigma 公司。HRP anti-Rabbit，批号：72234394；HRP anti-Mouse，批号：72233063均购自杭州联科生物科技有限公司。SW-CJ-2FD双人单面垂直流超净工作台，购自苏州光源净化科技有限公司；BB15 CO2培养箱，Multiskan酶标仪，Microcl 2R低温高速离心机均购自Thermo公司。

1.3 调脂颗粒含药血清的制备 将40只雌雄各半的SD大鼠随机分为两组，调脂颗粒组22只和空白对照组18只。按人-大鼠体表面积比值折算大鼠的等效剂量［11］，调脂颗粒组按照临床等效剂量的3倍浓度，得出大鼠灌胃药物浓度为0.06 g/kg［11］。按照实验要求，连续3 d，每日2次，调脂颗粒组大鼠灌胃2 mL调脂颗粒，空白对照组大鼠灌胃2 mL 0.9%氯化钠注射液。第4天灌胃1 h后乙醚麻醉，消毒，于超净工作台内腹主动脉取血，静置分层，离心，抽取血清，混匀，灭活，分装后置-80℃冰箱保存备用。

1.4 内皮细胞的培养及分组 内皮细胞以含10%胎牛血清配置的完全培养基培养于37℃、5%CO2的培养箱中，定期更换培养液，保证细胞生长状态良好。待细胞铺满至80%～90%，吸弃培养基，胰酶消化液消化、收集、离心、传代。传2～3代后用于实验分组，将内皮细胞分为空白对照组、调脂颗粒低、中、高剂量预处理组和AngⅡ组共5组。调脂颗粒低、中、高剂量预处理组分别加入适量的调脂颗粒含药血清（低剂量大鼠含药血清制备为1%含药血清∶9%空白血清∶90%完全培养基；中剂量大鼠含药血清制备为3%含药血清∶7%空白血清∶90%完全培养基；高剂量大鼠含药血清制备为9%含药血清∶1%空白血清∶90%完全培养基）预处理30 min后，根据实验要求加入终浓度为10-7mmol/L的AngⅡ培养 24 h。

1.5 观察项目 1）MTT比色法测定细胞活性。对传代至96孔板中生长面积为60%～70%血管内皮细胞，根据实验分组分别加入相应的药物，每组设3个复孔，培养 24 h 后加入 10 μL MTT 溶液（5 mg/mL），孵育 4 h后加入100 μL Formazan溶解液，继续培养直至普通光学显微镜下Formazan全部溶解，酶标仪570 nm波长测定吸光度。 2）Western blot检测 LC3-Ⅱ、beclin-1、SQSTM1/p62的表达。内皮细胞根据实验分组加入相应药物处理24 h，取适量的裂解液（每1 mL裂解液加10 μL PMSF）裂解 10 min，超声粉碎细胞 5～6 次，离心，收取上清，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，蛋白分离后300 mA，60 min转膜至PVDF膜上。室温下5%脱脂奶粉封闭孵育2 h，用相应的Ⅰ抗4℃孵育过夜，洗涤用HRP标记Ⅱ抗室温孵育1～1.5 h。于凝胶成像仪下显影，使用Image J的软件计算条带灰度值。3）免疫荧光法检测细胞内自噬小体的数量变化。将载玻片用0.1%明胶包被后放入24孔板，接种细胞常规培养，按各分组加入药物处理 24 h。PBS洗3遍后以1∶1丙酮∶甲醇固定液固定15 min， 以 0.1%Triton X-100避光孵育 10 min，1%BSA 封闭 60 min，以一抗（1∶1000稀释比）4 ℃过夜，以二抗（1∶1000稀释比） 孵育 60 min，DAPI避光孵育10 min，用 50 μL 浓度为 50%、75%、95%、100%的乙醇依次脱水，封片、固定、室温干燥后于激光共聚焦显微镜下观察。4）NO含量测定。将内皮细胞以各药物相应处理24 h后，加入NO专用裂解液裂解细胞，破碎离心后收集上清，使用总NO检测试剂盒检测NO浓度，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，最终用NO浓度除以蛋白浓度，即为每毫克蛋白里NO浓度。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析和t检验分析，计数资料采用等级资料的秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AngⅡ及调脂颗粒联合AngⅡ处理24 h对内皮细胞生存率（活力）的影响 见表1。待96孔板中内皮细胞铺满至70%～80%时，用AngⅡ（10-7mmol/L）及调脂颗粒联合AngⅡ处理24 h后进行MTT实验。结果如表1、图1，可见以AngⅡ刺激内皮细胞 24 h，吸光度与空白组没有明显差异；调脂颗粒含药血清预处理组与AngⅡ组及空白组比差异也没有统计学意义（P＞0.05），这表明加入各药物24 h后未造成细胞死亡，细胞生存率没有受到影响。

表1 各组血管内皮细胞生存率（活力）比较（±s）

表1 各组血管内皮细胞生存率（活力）比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与AngⅡ组比较，△P＜0.05。下同。

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图1 各组血管内皮细胞生存率（活力）比较

2.2 AngⅡ及调脂颗粒联合AngⅡ对血管内皮细胞自噬的影响 对6孔板中血管内皮细胞分别用AngⅡ及调脂颗粒含药血清联合AngⅡ处理24 h后，Western blot检测LC3-Ⅱ、beclin-1、p62表达量的变化。结果如图2、表2，AngⅡ组与空白对照组相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1表达量增多，p62表达量降低（P＜0.05），自噬总水平上升，提示AngⅡ诱导细胞自噬。和AngⅡ组相比，调脂颗粒低、中、高剂量组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1表达量减少，调脂颗粒中剂量组和高剂量组p62表达量升高（P＜0.05），调脂颗粒低剂量组p62表达量较AngⅡ组差异没有统计学意义（P＞0.05）。提示调脂颗粒能抑制AngⅡ诱导的细胞自噬增加。

图2 各组LC3、beclin-1、p62蛋白表达比较

表2 各组 LC3、beclin-1、p62 蛋白表达比较（±s）

表2 各组 LC3、beclin-1、p62 蛋白表达比较（±s）

组 别 n空白对照组 6 AngⅡ组 6调脂颗粒低剂量组 6调脂颗粒中剂量组 6调脂颗粒高剂量组 6 LC3蛋白1.0000±0.0000 1.3300±0.0529*0.6925±0.1212△0.6425±0.0822△0.7525±0.1307△beclin-1蛋白 p62蛋白1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.4475±0.1839* 0.7850±0.1266*0.8600±0.0583△ 1.2075±0.1987 0.6975±0.0793△ 1.3450±0.1690△0.8350±0.0714△ 1.1675±0.2216△

2.3 自噬小体免疫荧光结果 AngⅡ及调脂颗粒含药血清联合AngⅡ处理血管内皮细胞24 h，免疫荧光标记LC3B蛋白，图中胞质内绿色荧光小点即是自噬小体。计算不同组别的细胞内自噬小体数目，结果如图3、表3。空白对照组未见明显自噬小体，AngⅡ组较空白组自噬小体数量明显增多（P＜0.05）。而调脂颗粒含药血清联合AngⅡ组自噬小体数量较AngⅡ组明显减少（P＜0.05），调脂颗粒低中高剂量组自噬小体数量差异无统计学意义（P＞0.05）。据此提示AngⅡ能诱导血管内皮细胞的自噬水平上调，而调脂颗粒则能抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞的自噬水平上调。

图3 各组自噬小体的数目变化比较

2.4 NO含量检测 相应药物刺激24 h后，用NO总试剂盒检测NO含量，经统计后结果如图4、表4。AngⅡ组较空白组NO含量明显降低（P＜0.05）。而调脂颗粒低剂量与中剂量联合AngⅡ组NO含量较AngⅡ组明显升高（P＜0.05）；而调脂颗粒高剂量联合AngⅡ组NO含量较AngⅡ组差异无统计学意义。调脂颗粒低、中、高剂量组间NO含量差异无统计学意义。提示AngⅡ降低NO含量，可能引起血管内皮细胞自噬水平上调；而调脂颗粒预处理组则可能通过上调NO水平抑制AngⅡ诱导的细胞自噬增多。

表3 各组自噬小体的数目变化比较（±s）

表3 各组自噬小体的数目变化比较（±s）

组 别 n空白对照组 6 AngⅡ组 6调脂颗粒低剂量组 6自噬小体0.1667±0.3727 4.8333±1.0672*0.6667±0.7454△调脂颗粒中剂量组 6 0.5000±0.5000△调脂颗粒高剂量组 6 0.6667±0.7454△

图4 各组NO含量比较

表4 各组NO含量比较（±s）

表4 各组NO含量比较（±s）

组 别 n空白对照组 6 AngⅡ组 6调脂颗粒低剂量组 6 NO 1 0.7881±0.2039*1.4084±0.2885△调脂颗粒中剂量组 6 1.2686±0.2250△调脂颗粒高剂量组 6 1.2782±0.2741△

3 讨 论

随着社会发展和物质生活水平的提高，人们饮食结构及生活习惯的不断变化，As的发病率也日益升高，由As引发的心血管疾病仍然是导致人类死亡的主要原因之一。目前现代医学主要采取调脂、抗氧化应激等方法防治As及相关疾病，在临床上取得了一定成效。但西药花费多，并存在药物过敏、肝肾功能损害等副作用，制约着其在临床上的普及应用。中医药具有多途径、多靶点作用，为有效防治AS提供了可行性。

中医学并没有As这一病名，根据其症状、体征，当属眩晕、痰浊、血瘀的范畴。吴门医派是传统中医重要学术流派之一，在中医学史上有着浓墨重彩的一笔，温病学说是其核心内涵。苏州市中医医院已故名老中医汪达成主任医师结合多年临床经验以及吴门医派学术思想，并根据吴中地域多湿，经济发达，生活水平高这一地域特点，认为As因多由饮食不节，嗜食肥甘；七情内伤，气机不畅；年老体弱，肾精亏虚；这些均可导致肝、脾、肾脏腑功能失调，酿生痰浊，导致气机不畅，血行瘀滞。痰浊、瘀血胶着脉道，终致痰瘀阻络发而为病。病机以肝、脾、肾功能失调为本，痰浊、瘀血为标，并以“化痰祛瘀”理论为指导，创制调脂颗粒方，方用蒲黄、姜黄、泽泻3味中药，其中蒲黄为君，化痰活血升清泌浊；泽泻为臣，利水化湿，通肾之开合；姜黄兼佐使，理气疏肝，活血化癖，诸药兼顾化痰行血降脂，物美价廉，疗效颇丰，临床实践及实验室研究均表明苏州市中医医院调脂颗粒能够降血脂，在As治疗中扮演着重要角色。

自噬是真核细胞中普遍存在的一种生命现象，其清除变性错误折叠的氧化蛋白和老化受损的细胞器，有利于维持细胞的稳态［12］。在自噬过程中beclin-1作为构成Ⅲ类PI3K复合体的支架蛋白，与其他蛋白结合构成复合体，启动自噬［13］；LC3-Ⅰ在自噬基因的作用下，与磷脂酰乙醇胺共价结合在自噬体膜上形成LC3-Ⅱ后被溶酶体酶降解，LC3-Ⅱ是目前反映细胞内自噬水平的标记蛋白［14］。SQSTM1/p62是自噬体膜的受体蛋白，与自噬活性呈负相关性，反映自噬溶酶体溶解酶活性和自噬流的强弱［15］。本实验通过Western blot检测自噬相关蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1、SQSTM1/p62的表达及细胞免疫荧光观察细胞内自噬小体的数目变化，发现AngⅡ对血管内皮细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1蛋白表达有促进作用，对SQSTM1/p62蛋白表达有降低作用，并能促进自噬小体数目增多，以上结果均证明AngⅡ够诱导血管内皮细胞发生自噬。目前认为AngⅡ通过其Ⅰ型受体产生大量的ROS，从而引起氧化应激导致了内皮功能损伤［16］。本实验AngⅡ组的NO含量和空白对照组相比明显下降，表明AngⅡ诱导的内皮细胞自噬可能与NO含量降低有关。本实验发现调脂颗粒组能减少AngⅡ诱导的血管内皮细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin-1表达，促进SQSTM1/p62表达增加，抑制自噬体生成，同时NO含量明显增多。这表明调脂颗粒能够抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞自噬，其机制可能与增加NO表达量有关。

本研究中，调脂颗粒预处理组低中高剂量均对AngⅡ诱导的内皮细胞自噬水平升高起到抑制作用，但低、中、高剂量组间差异无统计学意义，猜测可能与剂量比例有关，接下来的实验则可以通过调整低、中、高剂量比例找到调脂颗粒含药血清干预AngⅡ诱导内皮细胞自噬的最佳浓度，以便更好指导临床工作。

近年来，自噬与心血管疾病的关系越来越受到人们的关注，相应的中医药研究也越来越多，此次实验是在既往对调脂颗粒研究的基础之上，深度探索调脂颗粒干预As新机制可能与干预血管内皮细胞自噬水平增加有关，能更好继承和发扬吴门医派的学术经验，服务社会，造福大众。

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