miR-638影响神经胶质瘤U251细胞发生发展研究

李勋华，钱立庭

（1.滁州城市职业学院，安徽 滁州 239000；2.安徽医科大学附属省立医院，安徽 合肥 230001）

当前胶质瘤的具体发病机制尚未明确，但普遍认为生物、遗传、环境等因素是诱发胶质瘤发生的重要原因.当前手术切除结合术后放化疗是主要的抗癌治疗方式，然而治疗效果不容乐观，患者的中位生存期大约为14个月[1].部分恶性程度较高的胶质瘤，如胶质母细胞瘤（GMB）具有干细胞类似的自我更新能力，且高度耐药，因而治疗效果更差，生存期也更短.同时，由于血-脑屏障和血-脑肿瘤屏障的作用，药物往往无法有效递送到肿瘤病灶.故当前探索胶质瘤发生发展的分子机制，以及在此基础上寻求更加具有特异性的治疗靶点是胶质瘤的研究重点.

组成微小RNA的单链小分子RNA可与信使RNA的3’-UTR序列互补配对结合，并影响细胞的生长、增殖、分化、侵袭、转移等进程.已有研究表明miRNA可以对胶质瘤细胞产生影响：降低miR-21表达可提升半胱天冬酶的活力，影响到肿瘤细胞的凋亡[2]；抑制miR-34a在U251细胞中的表达可改变c-Met、Notch-l、Notch-2及CDK6对肿瘤的促进作用[3].然而miR-638在胶质瘤中的功能性研究却很少，所以本研究的目的就是围绕miR-638对U251肿瘤细胞的影响展开的.

1 方法

1.1 细胞转染实验

以Lipofectamine 2000（脂质体）为载体转染，按照LipofectamineTM 2000转染试剂说明书，当细胞融合度达到60%～80%，每孔体积约2ml，参考Invitrogen公司相关实验建议，设计五个转染浓度，即miR-638模拟物与Lipofectamine 2000 浓度比分别为：7.5μl:7.5μl，5μl:5μl，4μl:4ul，2μl:2μl，另加设计空白对照组.

1.2 RT-PCR

提取细胞总RNA：根据Invitrogen说明书Trizol法展开RNA的提取.围绕NCBI数据库中的miR-638、U6基因序列，PCR引物采用Primer5.0软件设计，同源检索在Gene Bank进行，引物由blast验证特异性，由上海生工公司合成.

1.3 MTT检测转染miR-638模拟物后U251细胞增殖能力

实验共设共3组：miR-638模拟物转染组、模拟物对照物转染组、未干扰组（空白对照组，Mock组）；分别检测4个时间点：12h、24h、36h和48h.多功能酶标仪检测吸光度，557nm波长，观察细胞增殖，并绘制生长曲线图.

1.4 细胞划痕实验检测U251细胞迁移能力

细胞培养前用记号笔均匀划线.每孔加入细胞悬液2ml（细胞密度大约 3×105/ml），37℃、5%CO2培养箱中过夜培养.进行细胞转染，实验共设共3组：miR-638模拟物转染组、模拟物对照物转染组、未干扰组（Mock组），细胞转染后无血清培养基24小时，更换DMEM完全培养基.用小枪尖进行划痕操作.

CO2细胞培养箱继续培养48小时后，取出6孔板灭菌D’hanks洗2次，酒精轻轻擦拭干净marker笔标记的划痕，显微镜下观察划痕情况并拍照.

1.5 统计学处理以及图形处理软件应用

数据处理通过SPSS 20.0统计软件完成，结论数据均以±s表示，独立样本采用t检验，计数资料采用χ2检测.实验图形处理软件为Image J、Photoshop.

2 结果

2.1 miR-638在U251细胞中表达上升

RT-PCR实验结果见，相比正常人胶质细胞miR-638在U251胶质瘤细胞系中表达丰度较高（P＜0.01）.结果具有统计学意义，提示miR-638对胶质瘤的发生发展有促进作用.见图 1：

图1

(A)miR-638溶解曲线；(B)miR-638在NHA和U251细胞表达丰度的检测

2.2 活细胞工作站检测miR-638 mimics转染率

选用FAM标记的miR-638 mimics转染U251细胞，预实验结果表明，每孔细胞融合度约80%、Lipofectamine2000与FAM-miR-638 mimics浓度比为5 ul：5 ul时，转染率最高，浓度再往上升对转染效率影响不大.见图2：

图2 FAM-miR-638-mimics转染效率活细胞工作站荧光图

2.3 MTT检测miR-638对U251细胞增殖能力的影响

MTT法测定U251细胞系转染miR-638模拟物后不同时间的吸光度值，结果显示，与其他两组比较，转染了miR-638模拟物（miR-638 mimics）的U251细胞的增殖能力并无明显差异，结果无统计学意义 (p＞0.05).说明miR-638的表达对细胞增殖无影响.见图3：

图3 MTT法细胞增殖活性检测

2.4 细胞划痕实验检测miR-638对U251细胞系的迁移能力的影响

划痕操作后U251细胞悬液继续培养48h，显微镜下随机选取5个视野，观察细胞的迁移变化.可见，细胞均发生了不同程度的迁移.在转染了miR-638模拟物组中，U251细胞48小时候划痕间距明显窄与其他两组，即细胞迁移能力最强，说明miR-638表达对U251细胞的迁移能力有促进作用.见图 4：

图4 48h后各组细胞划痕创伤后愈合的图像

3 讨论

当前在胃肠道肿瘤和肺癌的相关实验中已证实miR-638的表达丰度发生了改变，并影响了癌组织的转化进程，其机理是miR-638发挥了重要的促肿瘤发生发展作用[4-6].在常见的肺癌类型鳞形细胞癌中，miR-638已经被发掘并成为鳞癌化疗效果的重要指标[7].但目前在胶质瘤中，miR-638对肿瘤的功能性研究却少之又少.

在肿瘤细胞中miRNA表达上升，通常认为是致癌基因的作用结果；相反，若其表达丰度下降则极有原因是致癌基因被抑制，所以miRNA有可能作为正常细胞和肿瘤细胞的标记物.而在胶质瘤U251细胞中，miR-638表达丰度明显提升，猜测miRNA-638可能通过调控某些致癌基因而对胶质瘤U251细胞产生影响.

由于体外实验不能完全模拟体内复杂的肿瘤环境，下一步我们将进行动物体内实验的验证.通过构建裸鼠荷瘤模型，利用miR-638激动剂和拮抗剂对移植瘤进行干预，进一步验证该实验结果.

〔1〕 D.R.Johnson,B.P.O’Neill,Glioblastoma survival in the United States before and during the temozolomide era,J.Neurooncol.107(2012)359–364.

〔2〕 Li Y,Guessous F,Zhang Y,et al.MicroRNA-34a inhibits glioblastoma growth by targeting multiple oncogenes[J].Cancer Res,2009,69(19):7569-76.

〔3〕 Lu J,Kwan B C,Lai F M,et al.Glomerular and tubulointerstitial miR-638,miR-198 and miR-146a expression in lupus nephritis [J].Nephrology(Carlton),2012,17(4):346-51.

〔4〕 Zhang J,Bian Z,Zhou J,et al.MicroRNA-638 inhibits

cell proliferation by targeting phospholipase D1 in human

gastric carcinoma[J].Protein&cell,2015,6(9):680-688.〔5〕Yin Y,Song M,Gu B,et al.Systematic analysis of key miRNAs and related signaling pathways in colorectal tumorigenesis[J].Gene,2016,578(2):177-184.

〔6〕 Lin Y,Li D,Liang Q,et al.miR-638 regulates differentiation and proliferation in leukemic cells by targeting cyclin-dependentkinase 2 [J].JournalofBiological Chemistry,2015,290(3):1818-1828.

〔7〕 Wang F,Lou J,Cao Y,et al.miR-638 is a new biomarker for outcome prediction of non-small cell lung cancer patients receiving chemotherapy[J].Experimental&molecular medicine,2015,47(5):e162.