富硒狮头柑功能成分和硒有机化程度分析

杨 旭YANG Xu

(1. 安康学院现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000；2. 陕西省富硒食品工程实验室，陕西 安康 725000)

狮头柑属芸香科柑橘属中的柑类，因其果皮有许多瘤状突起及明显肋起与沟纹，形如“狮头”而得名[1]。狮头柑果大、耐贮藏、酸甜适度、口感颇佳，含蛋白质、碳水化合物、无机盐、维生素等多种营养成分，具有降火明目、生津止渴等功效[2-3]。依托于中国第二大富硒区安康独特的地理地质环境，狮头柑作为当地名优传统果品具备天然富硒特色[3-4]。但就目前加工现状而言，狮头柑仍以鲜食为主，罐头、饮料、蜜饯类等深加工产品和从非食用部位提取的功能成分等深加工副产品很少，且资源推广缓慢[5-6]。已报道的文献[1-2, 5]多是对狮头柑果皮、果肉的香气成分及果实一般营养成分进行探究，而关于狮头柑多部位，尤以果汁、柑渣和种子的功能成分和各部位硒元素赋存情况的研究还未见报道，相关基础研究的缺乏制约了富硒狮头柑资源的开发利用。

本试验拟探究狮头柑果实的5个加工部位，即果皮、果肉、果汁、柑渣、种子中总多酚、类黄酮、抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素等功能成分的含量，并对各部位中总硒、无机硒含量及硒有机化程度进行分析，以期明确果实各部位的功能成分和硒元素的赋存情况，为富硒狮头柑的资源推广、深加工开展和市场开拓提供前期研究，从而寻求富硒狮头柑及其产品研发的新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

狮头柑：安康市旬阳县市售(产自吕河镇冬青村)；

硝酸、盐酸：优级纯，成都市科龙化工试剂厂；

芦丁、没食子酸标品：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；

类胡萝卜素、还原型谷胱甘肽标品：分析纯，上海如吉生物科技有限公司；

D-无水葡萄糖标品：分析纯，上海江莱生物科技有限公司；

硒标准储备液：1 000 μg/mL，国家标准物质研究中心；

其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

低速离心机：LD4-2A型，北京医用离心机厂；

恒温振动水浴锅：SHA-C型，常州国华电器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海跃进医疗器械有限公司；

高速万能粉碎机：FW-100D型，天津鑫博得仪器有限公司；

压榨机：JYZ-B6T型，中国九阳股份有限公司；

快速混匀器：XK96-A型，江苏新康医疗器械有限公司；

原子荧光光度计：AFS-930型，北京吉天仪器有限公司；

小型控温加热板：ECH-Ⅱ型，上海新仪微波化学科技有限公司；

温压双控微波消解仪：MDS-6型，上海新仪微波化学科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理 狮头柑样品清洗后，将果皮、果肉、种子分离，再对部分果肉进行压榨，粗滤后分别收集果汁和柑渣。果皮、果肉、种子和柑渣置于恒温干燥箱中，50 ℃干燥24 h后，粉碎过40目筛备用，果汁置于4 ℃保存。

1.2.2 功能成分的测定

(1) 总多酚含量：根据龚晓等[7]的多酚提取方法略作修改，分别称取果实不同部分的样品5 g，按1∶15 (g/mL)的料液比加入70%乙醇溶液，80 ℃水浴回流提取2 h，抽滤后定容至100 mL待测。提取液中总多酚含量测定采用Folin-Ciocalteu比色法[8]，以没食子酸为标准品，总多酚含量以mg没食子酸当量(gallic acid equivalents，GAE)/g干重表示。

(2) 总黄酮含量：样品中总黄酮的提取方法同1.2.2(1)所述。提取液中总黄酮含量测定采用氯化铝-亚硝酸钠比色法[9]，以芦丁为标准品，总黄酮含量以mg芦丁当量(rutin equivalents，RE)/g干重表示。

(3) 还原型抗坏血酸含量：根据黄仁华[10]38-39的抗坏血酸提取方法修改如下，分别称取果实不同部位的样品5 g，加入80 mL预冷的50 g/L三氯乙酸(含5 mmol/L EDTA-Na2)，冰浴研磨成浆，以5%三氯乙酸定容至100 mL，静置10 min后，15 000×g离心15 min，取上清液待测。提取液中还原型抗坏血酸含量测定采用BP显色法[11]，以抗坏血酸标品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。在同样的反应条件下，取1 mL上清液进行测定。

(4) 谷胱甘肽含量：样品中谷胱甘肽的提取方法同1.2.2(3)所述。提取液中谷胱甘肽的含量测定采用DTNB比色法[12]，以谷胱甘肽标品溶液绘制标准曲线。在同样的反应条件下，取1 mL上清液进行测定。

(5) 类胡萝卜素含量：参照文献[13]。

1.2.3 硒元素含量的测定 用体积分数为10%的HCl溶液稀释硒标准贮备液至10 μg/L，进样后原子荧光光度计将硒标准液分别稀释至0.00，1.00，2.00，4.00，8.00，10.00 μg/L，测定荧光强度值，绘制标准曲线。仪器工作条件参照GB 5009.93—2010和原子荧光光度计应用手册确定，具体参数见表1。样品消化方法参照MDS-6型微波消解仪推荐方法[14]略作修改。将狮头柑鲜果实5个部位分离，捣碎，分别称取不同部位的样品1 g于消化管中，加入6 mL硝酸后置于100 ℃控温加热板中消化，待不冒黄烟即取出冷却，而后加入2 mL双氧水和1 mL硝酸进行微波消解，至消解液无色透明，用体积分数为10%的HCl溶液定容至10 mL待测。微波消解程序见表2。

表1 原子荧光光度计工作条件Table 1 Operating conditions of atomic fluorescence spectrometer

表2 微波消解程序Table 2 Procedure of microwave digestion

1.2.4 无机硒的提取工艺优化

(1) 浸提温度对浸提液中无机硒含量的影响：准确称取5份果皮样品，均为5 g，按照1∶10 (g/mL)的料液比加水，分别置于80，85，90，95，100 ℃水浴浸提10 min，冷却后抽滤定容至50 mL。加入等体积环乙烷于磁力搅拌器上常温搅拌30 min，混合液移至分液漏斗静置30 min，取水相待测。

(2) 浸提时间对浸提液中无机硒含量的影响：准确称取5份果皮样品，均为5 g，按照1∶10 (g/mL)的料液比加水，于90 ℃水浴中分别浸提5，10，15，20，25 min，其他操作同1.2.4(1)所述。

(3) 料液比对浸提液中无机硒含量的影响：准确称取5份果皮样品，均为5 g，分别按照1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)的料液比加水，于90 ℃水浴浸提10 min，其他操作同1.2.4(1)所述。

(4) 响应面试验设计：根据单因素试验结果，以浸提温度、浸提时间和料液比为自变量，浸提液中无机硒含量为响应值，进行三因素三水平的Box-Behnken响应面试验。

1.2.5 硒有机化程度分析 准确称取果皮、果肉、果汁、柑渣、种子样品各5 g，测定各部分的总硒含量。以优化后的无机硒提取工艺条件分别提取各部分的无机硒，并测定硒含量。利用减差法[15]换算出硒有机化程度。

ROSe=[(TSe-ISe)/TSe]×100%，

(1)

式中：

ROSe——硒有机化程度，%；

TSe——总硒含量，μg/100 g；

ISe——无机硒含量，μg/100 g。

1.2.6 数据分析 所有数据以(均值±标准差)表示，每次样品的测定均重复3次。采用SPSS 19.0进行方差分析和差异显著性分析(P<0.05即为差异显著)。其中，响应面设计试验数据以均值表示，采用Design Expert 8对数据进行二次多项式回归拟合分析。

2 结果与分析

2.1 富硒狮头柑各部位功能成分含量

从表3中总多酚含量来看，果皮含量最高，果肉、果渣次之，且两者含量差异不明显，果汁为最低。按狮头柑失重率[16]以干重计的测定数据进行总多酚含量换算，均高于龚晓等[7]报道的以鲜重计芦柑、蜜柑、脐橙、沙田柚果皮、果肉中的总多酚含量；各部分的总黄酮含量变化趋势与总多酚含量基本一致，但果肉的含量高于柑渣。各部分黄酮类化合物占总多酚含量的56.56%～94.94%，说明狮头柑中多酚类化合物以类黄酮为主；还原型抗坏血酸、类胡萝卜素和谷胱甘肽3种成分的含量均为：果皮>果肉>柑渣>种子>果汁，其中前两种成分与其他柑橘类水果含量相当，谷胱甘肽含量则明显高于甜橙果皮(151.01 nmol/g)和果肉(50.38 nmol/g)中的[10]43。富硒狮头柑各部位功能成分含量的测定结果表明了果皮作为非可食部分的再利用价值。

2.2 无机硒提取工艺的优化结果

2.2.1 硒标准曲线的建立 硒标准曲线见图1。由图1可知，标准曲线的回归方程为I= 214.317 75C+ 9.751 0，R2=0.999 94。结果表明，硒浓度在0～10 μg/L内线性相关性良好。

表3 富硒狮头柑各部位中功能成分含量†Table 3 The contents of functional components in various parts of se-enriched Citrus

† 同列不同字母表示相互之间差异显著(P<0.05)。

图1 硒标准曲线Figure 1 Standard curve of selenium

2.2.2 单因素试验结果

(1) 提取温度：图2为浸提液中无机硒含量随浸提温度的变化曲线。随着浸提温度的不断升高，浸提液中无机硒含量呈现先增加后下降的趋势，当温度为90 ℃时，无机硒含量达到最大，为(0.155 5±0.003 0) μg/100 g。这是因为开始时提取温度的升高使溶剂分子有较激烈的运动，在加速渗透进入细胞和软化细胞壁的双重作用下，促使狮头柑果皮中无机硒的传质速度加快而更有利于其溶出。随着提取温度的继续升高，饱和蒸汽压增加，即使是使用回流装置提取，相同试验条件下提取剂的挥发作用仍会增强，从而使溶于其中的无机硒部分析出，导致含量的降低。因此，确定无机硒的适宜浸提温度为85～95 ℃。

不同字母表示相互之间差异显著(P<0.05)图2 提取温度对浸提液中无机硒含量的影响Figure 2 Effect of extraction temperature on inorganic selenium content of extracts

(2) 提取时间：浸提时间对浸提液中无机硒含量影响的试验结果见图3。浸提液中无机硒含量先随浸提时间的延长而逐渐增大，当提取时间为10 min时，无机硒含量达到最大，为(0.145 5±0.004 0) μg/100 g。此阶段随着时间的延长，原料与提取剂之间充分接触，使无机硒有效溶出。随后，提取时间继续延长，含量反而有所下降，可能是由于时间延长后，其他无效成分溶出对无机硒的溶出产生了影响。因此，确定无机硒的适宜浸提时间为5～15 min。

不同字母表示相互之间差异显著(P<0.05)图3 提取时间对浸提液中无机硒含量的影响Figure 3 Effect of extraction time on inorganic selenium content of extracts

(3) 浸提料液比：图4反应了料液比变化对浸提液中无机硒含量的影响。开始时随浸提剂的增加，无机硒在浸提剂中浓度较低，存在较大的浓度梯度，使其更易溶出，当料液比为1∶15(g/mL)时，无机硒含量达到最大，为(0.156 6±0.003 0) μg/100 g。而后此作用效应减弱，加之其他无效成分溶出增加，导致无机硒含量随浸提剂增加反而减小。因此，确定无机硒的适宜浸提料液比为1∶10～1∶20 (g/mL)。

不同字母表示相互之间差异显著(P<0.05)图4 料液比对浸提液中无机硒含量的影响Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on inorganic selenium content of extracts

2.2.3 响应面试验结果 在单因素试验结果的基础上，进行三因素三水平响应面试验设计(表4)，包含17组试验，具体试验方案及结果见表5。

采用Design Expert 8软件对试验数据进行二次多项式回归拟合，得到料液比、浸提温度、浸提时间与无机硒含量之间的回归方程：

表4 Box-Behnken试验设计因素水平表Table 4 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

表5 Box-Behnken试验结果Table 5 Results of Box-Behnken experiment design

Y=-11.262 19+0.014 991A+0.062 259B+0.243 08C+2.722 74E-004AB+4.286 50E-004AC-4.513 50E-004BC-1.846 10E-003A2-1.700 10E-003B2-1.349 72E-003C2。

(2)

表6为所得回归模型的方差分析。结果表明，所得模型F值为6.79，P值为0.009 7，具有显著性，由此说明建立的回归方程具有统计学意义。各因素中，浸提时间、料液比的二次项对综合指标无机硒的含量影响极显著，浸提时间的二次项和浸提温度的二次项对综合指标无机硒的含量影响显著。

根据拟合的多元回归方程得到各因素对无机硒含量综合指标影响的响应面图见图5。通过该组图可对3个考查因素中任意2个因素及其交互作用进行分析，并确定最佳的因素水平范围[17]。最终计算分析得到的最优组合为料液比1∶15.20 (g/mL)、浸提时间7.42 min、浸提时间91.22 ℃，此时无机硒理论含量为0.169 378 μg/100 g，比表5中第13组试验结果稍低，可能是试验误差造成的。为了确定所得到的优化工艺对无机硒的浸提效果，进行验证实验。在最优条件下，测得浸提液中无机硒含量为(0.170 8±0.003 6) μg/100 g，与理论最佳值基本一致，说明此方案合理可行。

表6 回归模型的方差分析结果Table 6 Results of variance analysis for regression model

图5 因素交互作用对浸提液中无机硒含量的影响Figure 5 Effect of factor interaction on inorganic selenium content of extracts

2.3 硒有机化程度分析结果

分别测定富硒狮头柑5个部位中的总硒含量，在优化的无机硒浸提工艺基础上，提取并测定无机硒含量，分析计算出有机硒含量及硒有机化程度，结果见表7。

根据DB61/T 556—2012 富硒食品及相关产品硒含量标准中富硒鲜水果硒含量为0.02～0.10 mg/kg的规定，确定选用的狮头柑达到富硒标准。从表7中可知，富硒狮头柑不同部位中总硒、无机硒和有机硒含量均为：果肉>种子>果皮>柑渣>果汁，且果肉中3项指标均显著高于其他部位，说明日常食用部位是狮头柑中硒的主要富集部位。有机化程度以种子最高，果肉次之，果皮为最低，平均有机化程度可达81.07%，表明以富硒狮头柑作为膳食补硒源，具有毒性小，硒的吸收率和生物利用率高等特点[18]。

3 结论

富硒狮头柑不同部位功能成分的研究结果表明，总黄酮、还原型抗坏血酸、谷胱甘肽和类胡萝卜素4项指标均呈现出果皮>果肉>柑渣>种子>果汁的变化趋势，果皮作为非可食部分，测定的功能成分含量均显著高于其他部位，因此对果皮的合理利用是将来富硒狮头柑资源全面开发的重要方向。与其他柑橘类水果的同种功能成分进行比较，富硒狮头柑中总多酚和谷胱甘肽含量相对较高，而总黄酮、还原型抗坏血酸和类胡萝卜素则含量相当，说明食用富硒狮头柑具有较好的功能性营养价值。本研究对富硒狮头柑中硒的有机化程度进行了分析，通过单因素和响应面试验设计，确定无机硒的优化提取工艺为：料液比1∶15.20 (g/mL)、浸提时间7.42 min、浸提时间91.22 ℃，在此条件下不同部位总硒、无机硒和有机硒含量测定结果表明，果肉是富硒狮头柑中硒元素的主要富集部位，且此食用部位的硒有机化程度可达82.85%，证实了其作为膳食补硒源的安全性。后续可对富栖狮并没有柑综合营养品质和硒的形态分析进行研究，以利于其资源的综合利用和产品质量的提升。

表7 富硒狮头柑不同部位硒有机化程度分析结果†Table 7 Results oforganic selenium ratio in various parts of se-enriched Citrus

† 同列不同字母表示相互之间差异显著(P<0.05)。

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