茶黄素抗氧化化学机制研究

谢 虹XIE Hong 罗志聪 - 李熙灿 -

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

红茶是一种全发酵型茶类，因其香气甜纯、滋味浓厚而广泛受到世界消费者的喜爱。茶黄素(图1)是红茶在发酵过程中，由简单儿茶素类聚合而成的黄烷醇类化合物[1]，是衡量红茶品质的重要因素。现代药理学研究表明，茶黄素有显著的抗肿瘤[2]、抗炎[3]、抗氧化作用[4-5]，是红茶发挥保健作用的重要物质基础。陈虎等[6]认为茶黄素能调节体内生物酶系的活性、防止低密度脂蛋白的氧化，修复生物系统的氧化损伤。最新的研究[7-8]还表明，茶黄素能通过hedgehog或Shh等信号通路限制肝的瘤变。但这些研究侧重阐明其抗氧化的生物机制，没有涉及化学机制。

本研究采用化学模式，研究茶黄素清除各种自由基的清除活性。在此基础上，进一步讨论其机制，以阐释茶黄素体内抗氧化的化学本质。

图1 茶黄素的结构式Figure 1 Structure of theaflavin

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

茶黄素(CAS：4670-5-7)：HPLC≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；

新铜试剂、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基、Trolox：HPLC≥98%，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

(NH4)2ABTS [2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]：美国Amresco公司；

K2S2O8、CuSO4、CH3COONH4、95%乙醇：AR级，广州化学试剂厂。

1.1.2 仪器设备

紫外-可见分光光度计：UV2100型，上海尤尼柯仪器有限公司；

电子天平：BS110S型，北京赛多利斯天平有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DPPH·清除能力的测定 依据文献[9]并做适量修改。称取1 mg DPPH，加入95%乙醇20 mL，超声使之完全溶解。取溶解后的DPPH·溶液1 mL与95%乙醇500 μL混合，利用紫外分光光度计在519 nm下测吸光度(A0)值。取该DPPH·溶液1 mL分别与20，40，60，80，100 μL的茶黄素溶液(0.1 mg/mL)混合，再向其中分别加入480，460，440，420，400 μL的95%乙醇使之总体积为1.5 mL，静置30 min 后，在519 nm下测吸光度值。平行测定3次。以Trolox(0.1 mg/mL)为阳性对照。样品清除DPPH·的能力按式(1)计算：

(1)

式中：

R——自由基清除率，%；

A0——未加样品液时所测吸光度值；

A——加入样品液时所测吸光度值。

1.2.2 ABTS+·清除能力的测定 依据文献[10]并做适量修改。取7.4 mmol/L (NH4)2ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液各1 mL混合，在室温避光下放置12 h，使之反应完全。用95%乙醇稀释此ABTS+·工作液，利用紫外分光光度计在734 nm下测A0值，调整A0至(0.7±0.02)。取该ABTS+·工作液800 μL，加茶黄素(0.025 mg/mL)xμL(x=15，30，45，60，75)，再加95%乙醇(200-x) μL，振摇10 s 以充分混合，然后在734 nm下测定吸光度值，平行检测3次。以Trolox (0.025 mg/mL)标准品为阳性对照。样品清除ABTS+·的能力按式(1)计算。

1.2.3 Cu2+还原能力的测定 依据文献[11]并做适量修改。取0.01 mol/L CuSO4溶液和7.5 mmol/L新铜试剂各125 μL混匀，依次加入茶黄素(0.1 mg/mL)xμL(x=15，30，45，60，75，90)、CH3COONH4缓冲液(700-x) μL，混合，静置30 min，于450 nm处测吸光度值，平行检测3次。以Trolox (0.1 mg/mL)标准品为阳性对照。样品Cu2+还原能力按式(2)计算：

(2)

式中：

S——Cu2+的相对还原率，%；

A0——未加样品液时所测吸光度值；

Amax——一次测量内最大的吸光度值；

A——加入样品液时所测吸光度值。

1.2.4 数据分析 每个样品重复3次试验，试验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 13.0对数据进行t检验。P<0.05 表示具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 DPPH自由基清除活性及机制

DPPH自由基是一种以N为中心的稳定自由基，由于其分子中存在多个吸电子的—NO2和苯环的大π键，所以氮自由基能稳定存在[12]。DPPH自由基的乙醇溶液为深紫色，其在517 nm处有强吸收。若与样品混合，反应液的颜色变淡，同时在517 nm下吸光度值减少，据此可以判断样品清除DPPH自由基的能力[13]。从图2中可以看出，在0～6 μg/mL 的浓度范围内，茶黄素清除DPPH·的能力逐渐增加，并且表现出良好的量效关系。其IC50=(7.7±0.1) μmol/L，小于Trolox的(见表1)，说明茶黄素清除DPPH·的能力强于Trolox。此前的文献[14]认为，氢原子转移(hydrogen atom transfer，HAT)是DPPH·清除涉及到的一种重要机制，活泼的DPPH·接受了一个氢原子后形成了稳定的DPPH—H分子。因此，DPPH·清除模型可以用来衡量抗氧化剂的HAT能力[15]。

依据文献[16]，茶黄素分子与DPPH·发生的反应，可表示为图3。在反应中，茶黄素上的邻二酚羟基(O—H键)发生均裂，失去H·后形成茶黄素自由基(I)，H·与DPPH· 结合生成稳定的DPPH—H分子。茶黄素自由基(I)，进一步转化为更稳定的邻苯醌式产物(II)。不难看出，正是邻苯醌式产物的稳定性，导致了茶黄素分子的强抗氧化活性。因此，茶黄素发挥其体外抗氧化作用可能与其具有的HAT能力有关。值得一提的是，茶黄素的邻苯醌式产物多存在于环状化合物，链状化合物由于不具有环状结构，无法转变为醌式结构，所以大多不表现出抗氧化活性(如十六酸)[17]。

表1 茶黄素和Trolox在各种抗氧化分析法中的IC50值†Table 1 The IC50 values of theaflavin and Trolox in several antioxidant assays

†IC50值是指当自由基的清除率为50%时样品的浓度；同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图2 茶黄素和Trolox的DPPH自由基清除率曲线Figure 2 The dose response curves of theaflavin and Trolox in DPPH·-scavenging assay

图3 茶黄素与DPPH·可能发生的反应式Figure 3 The proposed reaction of theaflavin with DPPH·

2.2 ABTS自由基清除活性及机制

ABTS法是一种经典的检测物质抗氧化能力的方法[18]，适用于天然的或合成的抗氧化剂[19]。(NH4)2ABTS与K2S2O8反应可以生成稳定的ABTS+·自由基，此自由基呈深绿色，在734 nm处有最大吸收。如果ABTS+·被样品清除，其734 nm的吸光度值会降低，颜色变浅。据此，可以来判断样品清除ABTS+·的能力[20]。从图4中可以看出，在0～2 μg/mL的浓度范围内，茶黄素清除ABTS+·的能力与其浓度形成良好的量效关系。其IC50值为(2.3±0.1) μmol/L，小于Trolox的(见表1)，说明茶黄素清除ABTS+·的能力强于Trolox。通常认为ABTS+·被清除的机制是电子转移(ET)的过程(ABTS+· +e→ ABTS)[21]。据此推测，茶黄素有较强的ABTS+·清除能力，其清除过程至少包括ET机制。

2.3 Cu2+还原能力及机制

抗氧化剂对金属离子的还原能力，也可用于衡量其活性强弱[22]。从图5中可以看出，在0～90 μg/mL的质量浓度范围内，茶黄素对铜离子的相对还原率与浓度呈现出良好的线性关系。其IC50=(9.2±0.2) μmol/L，小于Trolox的(见表1)，表明茶黄素还原Cu2+的能力强于Trolox。文献[20]表明，Cu2+被还原成Cu+是电子转移的过程。这进一步印证了茶黄素具有ET能力的推测。

图4 茶黄素和Trolox的ABTS+·清除率曲线

Figure 4 The dose response curves of theaflavin and Trolox in ABTS+·-scavenging assay

图5 茶黄素和Trolox 的相对Cu2+还原能力浓度曲线

Figure 5 The dose response curves of theaflavin and Trolox in Cu2+-reducing assay

3 结论

作为一种存在于红茶中的天然抗氧化剂，茶黄素在DPPH自由基清除、ABTS清除、Cu2+还原力3个方面，其活性均明显强于Trolox。它的抗氧化作用可能涉及氢原子转移(HAT)和电子转移(ET)。并且通过HAT机制，茶黄素可转化为稳定的邻苯醌式产物。此研究阐明了茶黄素抗氧化的化学机制，有助于理解抗氧化活性与结构的关系，为茶黄素类衍生物的开发利用提供理论基础。但该试验对于茶黄素所涉及的化学机制研究尚不全面，仍有待进一步分析完善。

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