中空纤维离心超滤法测定乳制品中5种添加剂

刘彦，张岩，付海丽，刘睿思，蒋晔

（河北医科大学药学院，河北石家庄050017）

山梨酸、苯甲酸和脱氢乙酸均具有抑菌或抗菌作用，常作为防腐剂用于食品工业生产中；安赛蜜和糖精钠为常用的食品矫味剂，一般在食品加工中用来改善口味。上述5种食品添加剂均广泛应用于各类食品中，但过量摄入会对人体造成危害，特别是肝、肾器官，甚至引发癌症[1]。因此，在国家颁布的GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[2]中对乳制品中食品添加的类别和限量做了明确规定，安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的限用量分别为0.3、1.0、0.5、0.3 g/kg，含乳饮料中糖精钠的限用量为0.15 g/kg。

目前，已有文献报道食品中防腐剂和矫味剂的含量测定方法，常见的有高效液相法（chromatography high performance liquid，HPLC）[3-7]、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）[8]、气相色谱法 （gas chromatography，GC）[9]、离子色谱法[10]、高效液相质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[11]等。由于乳制品基质较为复杂，含有大量蛋白质、脂肪等可影响色谱分析准确度的大分子物质，因此，该类样品分析检测前需进行样品前处理。文献中去除蛋白质等大分子物质常采用沉淀蛋白法[12-15]，或联合液液萃取[16]、固相萃取[17]等方法对样品进一步纯化，操作过程繁琐、耗时，且易造成偶然误差降低结果准确度。因此，本文采用新型的中空纤维离心超滤装置，无需沉淀蛋白，一步即可完成分离、纯化过程，且首次用于同时测定乳制品中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸的含量，其结果准确、可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与样品

U3000高效液相色谱仪：戴安（美国）；聚砜中空纤维、聚丙烯中空纤维（膜厚 200 μm，内径 1 mm）：杭州凯洁膜分离技术有限公司；苯甲酸对照品（批号：100419-201302）：中国药品生物制品检定所；山梨酸对照品（批号：40124）：德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH；糖精钠对照品（批号：40904）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；安赛蜜（批号：60263-06-1）：中检所；脱氢乙酸（批号：YSJ-04260G）：上海远慕；早餐奶（批号：2P20170616 BU03）：内蒙古蒙牛乳业股份有限公司；酸奶（批号：20170712.05）：北京三元食品股份有限公司；养乐多（批号：20170708）：养乐多（中国）投资有限公司；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

采用DiamonsilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.02mol/mL乙酸铵溶液（4∶96，体积比），流速为1.0mL/min，检测波长分别为230 nm（安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸）、254nm（糖精钠），进样量5μL。

1.3 溶液配制

对照品溶液：精密称取安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸对照品分别为 10.00、10.02、10.01、10.00、9.98 mg，置10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，用水稀释至刻度，摇匀，分别得对照品贮备液浓度为1.000、1.002、1.001、1.000、0.998 mg/mL。

供试品溶液：精密称取待测样品溶液1.0 mL，置5 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得样品溶液。

1.4 中空纤维离心超滤法

将中空纤维切成15 cm的小段，放入甲醇-水（50∶50，体积比）混合溶液中超声清洗30 min，晾干备用。吸取0.5 mL样品溶液注入自制玻璃管（长度：7.5 cm，内径：3 mm），将洗好备用的中空纤维置于玻璃管中（装置图见图1），以4 000 r/min离心15 min，然后取出中空纤维，收集中空纤维内的液体，即得供试品溶液。

图1 离心超滤装置图Fig.1 Diagram of hollow fiber ultrafiltration

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 样品前处理方法的选择

乳制品基质复杂，含有大量蛋白质、脂肪等大分子物质，可影响色谱分析，因此，检测前均需进行样品前处理。传统的乳制品样品前处理方法均为沉淀蛋白法，或联合液相萃取、固相萃取等方法，操作繁琐、费时，且易造成损失导致结果误差较大。而中空纤维离心超滤技术主要应用于复杂基质中小分子物质的分离、纯化，如成分复杂的制剂中小分子物质的检测[18]、药物小分子与高分子聚合物的分离[19-20]或游离药物的测定[21]等。该方法仅通过离心操作即可去除蛋白质等大分子杂质，滤液可直接进样，装置简单，操作快捷；且在该方法中离心力的方向与中空纤维的轴向方向始终处于平行的状态，有利于克服浓差极化现象，使得结果更加准确、可靠。因此，本文采用中空纤维离心超滤法用于乳制品中防腐剂和矫味剂的分析测定。

2.1.2 非特异性吸附的考察

非特异性吸附是中空纤维膜分离过程中的常见现象，因此，本试验分别考察了聚砜、聚丙烯两种膜材对苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、脱氢乙酸和糖精钠的吸附性。取浓度为10 μg/mL的混合对照溶液，按1.4项下进行离心超滤，进样分析并计算回收率。结果表明：膜材为聚砜的中空纤维对脱氢乙酸和安赛蜜有明显的吸附作用，回收率＜70.0%；而膜材为聚丙烯的中空纤维对5种待测物质几乎不吸附，回收率＞93.5%，故选择聚丙烯中空纤维作为膜材料。

2.1.3 离心转速的优化

采用样品前处理方法是离心超滤法，滤过速度和滤过液的量主要取决于离心力。文中考察了离心时间为 15 min 时，离心转速分别为 2 000、4 000、6 000、8 000 r/min滤过液的量，结果表明，当离心转速为4 000 r/min时滤过液体积基本趋于稳定，因此，选择离心条件为 4 000 r/min，15 min。

2.2 系统适用性试验

在1.2项色谱条件下，分别取5种混合对照品溶液（浓度约为20 μg/mL）及早餐奶加样样品溶液（5.05 μg/mL）进样分析，记录色谱图（图2），由图可见，5种待测物质在上述色谱条件下完全分离，峰形良好，且供试品溶液未有干扰。

图2 混合对照品溶液、早餐奶加样样品溶液色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substance solution and sample solution

2.3 线性、检测限和定量限

分别精密量取安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠对照品贮备液各1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相定容，得各组分浓度约为100 μg/mL混合对照溶液，依次稀释得各组分浓度分别为0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的混合对照溶液，按 1.2 项下色谱条件测定，以各组分峰面积对其质量浓度进行线性回归，结果见表1。

取对照品溶液，逐级稀释各对照品进样，当峰高为基线噪音的3倍和10倍量时，测得5种待测物质的检测限及定量限，结果见表1。

表1 线性回归方程及相关系数Table 1 The equations of linear regression and correlation coefficients

2.4 精密度、稳定性与重复性试验

取浓度为10.0 μg/mL的混合对照品溶液，按1.2项下色谱条件，连续进样6次，记录各待测物质峰面积，计算得安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠峰面积的RSD分别为0.8%、0.3%、0.2%、0.2%、0.2%，结果表明该方法精密度良好。

取早餐奶一份，5种待测物质加样浓度为10.0 μg/mL，按1.4项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8 h进样，记录峰面积，计算得5种待测物质峰面积的RSD均小于1.0%，结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

取同一早餐奶样品5份，5种待测物质加样浓度为10.0 μg/mL，按1.4项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积，计算得5种待测物质峰面积的RSD均小于1.3%，结果表明该方法重现性良好。

2.5 回收率试验

精密量取早餐奶、酸奶、养乐多各9份，每份1.0mL，置5 mL量瓶中，每种样品3份为一组共3组，3组样品分别加入各待测物质的对照品储备液25、50、100 μL，加水定容，得加样浓度分别为5.00、10.0、20.0 μg/mL的样品溶液。按照1.4项下方法制备供试品溶液，记录峰面积，得回收率结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=3）Table 2 Results of the recovery tests（n=3）

2.6 样品测定

取早餐奶、酸奶、养乐多3种样品，按照1.4项下方法制备供试品溶液，分别对早餐奶、酸奶、养乐多中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸含量进行分析测定（色谱图见图3），每种样品平行制备3份，取含量平均值，结果见表3。由结果可知，仅在养乐多样品中检测到苯甲酸，含量未超标，符合GB 2760-2014要求范围。

图3 早餐奶样品、酸奶样品、养乐多样品色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of breakfast milk sample solution，youhurt sample solution and YangLeDuo sample solution

表3 样品含量测定结果Table 3 The determination results of sample content

3 结论

建立中空纤维离心超滤法用于分析乳制品中5种食品添加剂的含量，该方法经一步样品前处理方法即可除去乳制品中大分子物质，省时省力，且准确度高，回收率均大于93.5%，RSD<1.4%，为乳制品中食品添加剂的含量分析提供了简便、快捷、可靠的检测手段。

[1]石立三,吴清平,吴慧清,等.我国食品防腐剂应用状况及未来发展趋势[J].食品研究与开发,2008,29(3):157-161

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2014

[3]孙稚菁,任国杰,王灵芝,等.果脯蜜饯和果冻中10种食品添加剂的同时测定[J].食品研究与开发,2017,38(7):133-137

[4]罗亮,姚帮本,吴巧.高效液相色谱法测定食品中5种防腐剂和甜味剂[J].安徽农业科学,2016,44(10):95-97

[5]盛琦,刘素娟,冯峰,等.高效液相色谱法同时测定8种食品添加剂[J].湖北农业科学,2016,55(21):5620-5622

[6]高文惠,庞军,高林,等.高效液相色谱法同时测定食品中多种添加剂[J].中国食品学报,2014,14(12):148-153

[7]林海丹,邹志飞,秦燕,等.高效液相色谱法同时测定食品中18种食品添加剂[J].食品科学,2013,34(8):228-231

[8]郭芳芳,冯锋,白云峰,等.高效毛细管电泳-紫外检测法同时检测雪糕中多种添加剂[J].食品科学,2015,36(8):206-210

[9]周家萍,李典,李治东,等.气相色谱法同时测定食品中8种防腐剂[J].食品研究与开发,2017,38(14):161-163

[10]朱怀远,庄亚东,熊晓敏,等.离子色谱法直接测定食品添加剂中的甜蜜素[J].食品科学,2012,33(2):173-176

[11]曹娅,孙利,凌云,等.液相色谱-串联质谱测定食用植物油和调味油中27种添加剂(物)[J].食品科学,2013,34(4):129-134

[12]袁凤琴,王佳,牛爱华,等.高效液相色谱法同时检测酸性乳饮料及冰淇淋中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量[J].食品安全质量检测学报,2014,5(5):1434-1438

[13]李素琴,赵贞,刘丽君,等.高效液相色谱法检测乳制品中7种添加剂[J].乳业科学与技术,2016,39(4):22-25

[14]霍艳敏,段文增,王骏,等.高效液相色谱法同时测定乳制品中7种防腐剂[J],理化检验-化学分册,2013,49(5):580-583

[15]赵贞,万鹏,李翠枝,等.HPLC法检测乳制品中2种甜味剂和3种防腐剂[J].中国乳品工业,2014,42(2):58-59,64

[16]张敬波,姜俊,佟克兴,等.气相色谱法测定乳制品中的脱氢乙酸和对羟基苯甲酸酯[J].中国乳品工业,2013,41(4):45-47

[17]杨红梅,王浩,郭启雷,等.固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶及蛋白类饮料中10种防腐剂[J].食品研究与开发,2011,32(5):123-126

[18]安静,董占军,孙源.HPLC法测定茵栀黄口服液中的黄芩苷[J].华西药学杂志,2015,30(2):236-237

[19]豆妮娜,冉丛聪,杜朝晖,等.中空纤维离心超滤-HPLC法测定酮洛芬凝胶剂[J].中国医药工业,2016,47(1):71-73

[20]许萌,陈丹,蒋晔.中空纤维离心超滤-HPLC法测定注射用两性霉素B脂质体的包封率[J].沈阳医科大学学报,2014,31(9):692-696

[21]Junmei Li,Qingwen Shi,Ye Jiang,et al.Pretreatment of plasma samples by a novel hollow fiber centrifugal ultrafiltration technique for the determination of plasma protein binding of three coumarins using acetone as protein binding releasing agent[J].Journal of Chromatography B,2015,1001:114-123