镇喘保肺汤对支气管哮喘肾气虚证模型大鼠尿液代谢组学研究

郑建平 宋红

支气管哮喘（简称哮喘）是全球最常见的慢性疾病之一，资料显示全世界约有3亿哮喘患者，且近年来有上升趋势［1-2］。王大伟等［3］认为肾虚贯穿于哮喘发病的全过程。目前西药如吸入糖皮质激素虽能治疗哮喘，但长期使用会导致反射性咳嗽、支气管痉挛、骨质疏松、感染、生长受限等副作用［4］。而中医药以整体观念为指导，充分应用中药多靶点解毒抗炎、增效减毒等优势，还能改善患者过敏体质、增强免疫力，临床疗效好，且不易复发［5-6］。镇喘保肺汤由人参、三七、附子、五加皮、何首乌、沉香、蛤蚧组成，临床治疗急性发作的虚证哮喘，具有良好的疗效。2015年5月至2016年3月作者通过实验研究，探讨镇喘保肺汤治疗肾气虚哮喘的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠36只，体重200～250g，SPF级，雄性，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。

1.2 主要仪器与试剂 OVA卵清蛋白（sigma公司），氢氧化铝凝胶（上海美兴化工股份有限公司），0.9%氯化钠注射液（科伦制药有限公司），梅花针（固始公元医疗器械有限公司），5417R型冷冻台式高速离心机（德国Eppendorf公司），超声雾化吸入器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司），超高效液相质谱联用仪（德国安捷伦公司）。

1.3 药物 镇喘保肺汤由人参15g、三七12g、附子15g、五加皮 15g、何首乌 10g、沉香 1g（研末）、蛤蚧 1.5g（研末）组成。购自浙江中医药大学中医门诊部，经中药制剂室鉴定。

1.4 方法 （1）动物与分组：清洁级雄性Wistar大鼠36只，体重200～250g，随机分为正常对照组，肾气虚哮喘模型组以及中药组，每组12只。（2）动物模型制备：肾气虚哮喘模型组和中药组于实验的第1、8、15天共3次在腹腔分2点注射10%卵白蛋白生理盐水溶液1ml致敏；第3次致敏1周后，模型组和中药组动物每日超声雾化吸入1%卵白蛋白生理盐水溶液20min，诱发其哮喘发作，直至雾化时出现大鼠发生打喷嚏、咳嗽、呼吸困难和喘息、大小便失禁、抓耳朵、发绀等症状说明大鼠模型制备成功，连续激发21 d。正常对照组予生理盐水代替抗原进行致敏和激发。（3）给药处理及样本采集：中药组大鼠于实验第15天（即激发第一天）开始给予镇喘保肺汤2.0 g/kg（灌胃），正常对照组、肾气虚哮喘哮模型组给生理盐水灌胃。各组大鼠分别干预15d（实验第30天）处理，称体重，取晨尿，置于-80℃环境中冷冻备用。（4）液质联用尿液样本制备：将储存在-80℃环境下的尿液取出并自然解冻，然后将200μl尿液与600μl水液混合在EP管内，放置于涡轮仪以4℃，12000r/min，离心10min，等待液质联用分析。（5）液质联用技术分析：液质联用技术可以充分采集到大鼠尿液中的中药化学成分并加以分析，同时还可以得到中药化学成分的保留时间、紫外光谱、分子量及特征结构碎片等丰富信息。将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量（rt_mz，即保留时间_质荷比）、分子量（mass）观察量（样本）和峰强。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件（版本13.0）进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘方判别分析（PLS-DA）。进一步采用有监督式方法OPLSDA进行建模分析此模型可靠程度。

2 结果

2.1 一般情况 实验处理过程中大鼠有部分死亡，最终正常组8只，反应灵活，毛发光泽，进食及二便正常。肾气虚哮喘组9只，活动明显减少，毛发枯燥，反应迟缓，纳少，体重增幅减轻，悬尾及游泳时间缩短等肾气虚表现。中药组10只，状态较肾气虚哮喘组均有明显好转。

图2 Z-M两组的PCA得分图（pos）

2.2 PCA分析 K组、Z组与M组的聚类现象比较明显，表明各组间尿液代谢物存在显著差异。见图1、2。2.3 PLS-DA分析 图3、图4的R2Y和Q2均＞0.4，且从排序验证图看模型不存在“过拟合”现象。因此认为该模型可靠，并且组间存在显著差异。

图3 M-K两组的PLS-DA得分图（pos）及排序验证图

图4 Z-M两组的PLS-DA得分图（pos）及排序验证图

2.4 OPLS-DA分析 采用有监督式方法OPLS-DA进行建模分析，R2Y和Q2仍＞0.4，进一步表明该模型可靠。见图5、6。

图5 M-K两组的OPLS-DA得分图（pos）

图6 Z-M两组的OPLS-DA得分图（pos）

2.5 差异代谢物的鉴定 见表1、2。

表1 正模式下Z-M两组的差异性代谢物

表2 正模式下M-K两组差异性代谢物

3 讨论

镇喘保肺汤是由人参、三七、附子、五加皮、何首乌、沉香、蛤蚧组成。现代药理学研究表明，其具有良好的抗炎、增强免疫功能的作用。另外，人参、三七、附子、五加皮、蛤蚧还能够刺激垂体-肾上腺皮质系统，提高机体应激状态，同时兴奋垂体性腺，对机体呈现雌激素和雄激素样作用。

代谢组学是研究生物体内源代谢物的种类、数量及其在内外因素下变化规律的组学技术［7］，是以组群指标为分析基础，通过高通量检测和数据处理，同时对特定时期内所有的内源性低分子物质进行定性和定量分析，这与中医学整体观念和辨证论治的理论内涵相一致［8-9］。色谱和质谱联用技术，特别是高分辨质谱凭借其普适性、高灵敏度和特异性的特点，逐渐成为代谢组学研究的主流技术［10］。液质联用技术已经成为中药各类成分分析的重要手段，其所提供的大量结构信息不仅对中药成分的分析鉴定提供依据，也为中药或中药复方的体内过程研究和代谢产物的分析奠定基础，对中药物质基础和作用机制的研究发挥着重要作用［11］。

肾上腺糖皮质激素主要作用是调节糖、蛋白及脂肪的代谢，生理剂量的糖皮质激素是维持人体正常机能活动所必需的，而超过生理剂量的激素则突出的表现为抗炎、抗毒、抗过敏的药理作用［12］。相对于正常组，肾气虚哮喘模型组的皮质酮、尿可的松、脱氧皮质酮明显下降，表明哮喘组大鼠肾上腺皮质功能减退，下丘脑一垂体一靶腺轴功能被破坏［13］，进而导致脂类代谢失常，大鼠出现行动迟缓、蜷缩倦怠、毛发枯燥等肾气虚的证候。大量临床及动物研究表明，哮喘反复难愈的原因之一就在于其本身存在下丘脑-垂体-靶腺轴不同程度的抑制现象，同时出现内源性糖皮质激素受体缺陷，而糖皮质激素只有和受体结合后才能发挥作用［14］。相对于哮喘组，中药组大鼠在服用镇喘保肺汤治疗后，皮质酮、尿可的松、脱氧皮质酮明显上升，肾气虚症状及哮喘明显好转，表明镇喘保肺汤对治疗肾气虚哮喘有一定治疗作用。其作用机制可能是通过兴奋下丘脑-垂体-靶腺轴，且提升内源性糖皮质激素受体含量，增加糖皮质激素与受体结合实现的［15］。同时中药组大鼠出现21-羟基孕烯醇酮、2-羟基雌二醇、雌激素酮等雌激素的升高。有研究表明，雌激素可提高血中载脂蛋白A1的含量，降低血清总胆固醇浓度，使β-脂蛋白减少、胆固醇和磷脂比例下降，有助于改善脂类代谢紊乱［16］。β-谷甾醇作为一种植物甾醇具有明显降低血清胆固醇的功效。中药组β-谷甾醇含量升高，提示镇喘保肺汤可能正在改善脂类代谢。相对于正常组，模型组大鼠二十四碳六烯酸、硬脂酸的含量升高，提示体内脂肪酸代谢紊乱，免疫力下降，肝肾受损。在服用镇喘保肺汤后，大鼠二十碳五烯酸、二十二烷酸等脂肪酸开始下降，表明镇喘保肺汤能够改善脂肪酸代谢，增强肝肾功能，提高机体免疫能力。

［1］ 石志红, 石志福. 支气管哮喘的国内外研究进展. 中国民族医药杂志, 2014, 20(11): 62-65.

［2］ 全国儿科哮喘协作组.第三次中国城市儿童哮喘流行病学调查. 中华儿科杂志, 2013(10).

［3］ 王大伟,朱慧志.补肾法治疗支气管哮喘的研究进展.中医药临床杂志,2015,27(10):1492-1494.

［4］ 孟庆岩, 韩晓华, 许兴福, 等. 中西医治疗咳嗽变异性哮喘研究进展.临床医学,2016,29(28):44-45.

［5］ 梅周芳,吴宜.支气管哮喘的药物治疗进展.中国医学创新,2017, 14(8): 145-148.

［6］ 左英俊, 武清敏. 中西医结合治疗对小儿支气管哮喘肺通气功能及免疫功能的影响. 河北中医, 2016, 38(6):871-875.

［7］ 汪明明, 程海婷, 薛明. 基于LC-MS的代谢组学分析流程与技术方法. 国际药学研究杂志, 2011, 38(2):130-136.

［8］ 黄泓轲,罗健玮.代谢组学在中药现代化研究中的应用.产业与科技论坛,2016,15(9):63-64.

［9］ 贾连群, 甄毕贤, 徐荧,等. 应用液质联用技术研究脾虚大鼠血清代谢物谱群特征. 中国中西医结合杂志, 2016(3):359-365.

［10］ 汪明明, 程海婷, 薛明. 基于LC-MS的代谢组学分析流程与技术方法. 国际药学研究杂志, 2011, 38(2):130-136.

［11］ 罗芬.液-质联用技术在中药分析中的应用.亚太传统医药,2014,10(11):52-54.

［12］ 徐克成.肾上腺皮质激素的临床药理.中国实用内科杂志,1990, 10(12): 619-620.

［13］ 宋红, 郑小伟, 鲍晓东, 等. 基于核磁共振技术的模式识别方法在肾气虚哮喘大鼠血清代谢组学中的应用. 中华中医药杂志,2017, 32(1): 259-262.

［14］ 许建华, 范忠泽, 吴敦序, 等. 补肾定喘汤对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体及血浆皮质酮、ACTH 的影响. 中国中医基础医学杂志, 2003, 9(1): 27-29.

［15］ 年宏蕾, 杨燕, 罗良涛, 等. 淫羊藿及女贞子协同布地奈德对哮喘大鼠糖皮质激素受体及抗炎作用的影响. 北京中医药, 2016(2): 118-121.

［16］ 王晓栋, 魏嵋. 具有雌激素样作用中药对脂代谢影响. 泸州医学院学报, 2008,31(2): 217-218.