乌药醇提取物抗慢性酒精性肝损伤量效关系研究

汪洋鹏 刘磊 张光霁 何志刚 楼招欢⋆

乌药为樟科植物乌药的干燥块根。为现行《中国药典》收载的品种，含有挥发油、异喹啉生物碱及呋喃倍半萜及其内酯三大类，具有行气止痛，温肾散寒等功效［1］。近年研究发现，乌药能有效降低CCL4、乙硫氨酸所致肝损伤动物血清转氨酶水平，保护肝脏免受脂肪浸润［2］。乌药不同提取物能显著降低酒精性肝损伤模型大鼠血清TC、TG、ALT、AST含量，改善肝组织病理学改变，其中以乌药醇提取的作用相对较优［3-4］。2016年10月至12月作者通过实验研究，观察不同剂量乌药乙醇提取物对慢性酒精性肝损伤模型动物血生化指标及炎症因子水平的干预作用，为进一步研究乌药抗酒精性肝损伤作用及机制提供剂量参考。

1 材料与方法

1.1 动 物 体 重18～20g的 雄 性ICR小 鼠， 购自浙江省实验动物中心，动物质量合格证号：NO.1610100014，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。在室温（23±2）℃，相对湿度 50%～70%饲养环境饲养，自由饮水饮食。

1.2 药物与试剂 乌药醇提取物制备：取乌药饮片（浙江中医药大学中药饮片厂），加入10 BV量70%（v/v）乙醇，回流提取2次，提取液合并，减压回收并浓缩至适当体积，用蒸馏水配制成乌药浓度为4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg，分装后放置冰箱内保存，获得不同剂量的乌药醇提取物；阳性对照-易善复：易善复胶囊溶于蒸馏水中，用超声波乳化，制成2.05mg/ml的乳剂。造模试剂：红星二锅头酒（酒精度52%，北京红星股份有限公司）用时与纯水按一定体积比例稀释至所需灌胃浓度。ALT（16052001）、AST（16091901）、TC（15100801）、TG（16030301）、HDL-C（16031401）试剂盒购自宁波美康生物科技股份有限公司；IL-6（220661232）、IL-1β（2201B61232）ELISA试剂盒购自联科生物技术有限公司。

1.3 仪器 Powerwave340酶标仪，美国Bio-TEK公司；TBA-40FR全自动生化仪，日本东芝医疗系统株式会社；XHF-D高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Heraeus Biofuge Stra冷冻离心机，德国Heraeus；wh-861涡悬混合器，太仓市科教器材厂；DS-671电子计重秤，上海寺冈电子有限公司。

1.4 方法 （1）模型复制及给药：取ICR小鼠，按体重随机分为9组，即正常对照组、模型对照组、易善复对照组（205.2mg/kg）、乌药醇提取物4g/kg组、乌药醇提取物2g/kg组、乌药醇提取物1g/kg组、乌药醇提取物0.5g/kg组、乌药醇提取物0.2g/kg组、乌药醇提取物0.1g/kg组，每组各8只。所有小鼠均给予基础饲料，自由饮水饮食。除正常对照组外，其余各组小鼠于每天上午8：00灌胃，按0.1ml/10g体重量给予不同浓度白酒，在2周内白酒浓度，按30%～45%递增，连续灌胃4周复制慢性酒精性肝损伤模型。从造模第l天起，除正常对照组和模型对照组灌服蒸馏水外，其余各给药组分别灌胃相应的药物，1次/d，连续6周。（2）指标检测：①一般行为学观察：观察毛发、饮食状况、运动情况，体重测定1次/3d。②血液生化学指标及氧化指标的影响：于造模2、4、6周采血，3500 r/min离心10min，分离血清，全自动生化仪测定血清 ALT、AST、TC、TG、HDL-C水平。③血清炎症因子水平检测：于造模 4、6 周采血，离心制备血清，ELISA 法测定血清中IL-1β、IL-6水平。④肝脏指数检查：实验期末，解剖小鼠后，快速分离肝脏，血渍用冰生理盐水洗净，滤纸吸干血渍，称量肝脏质量，计算肝指数。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对ALI模型小鼠体重及肝指数的影响 与正常组比较，随着造模时间的延长，ALI小鼠体重呈逐渐下降趋势，其中第2、4、6周差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型比较，乌药各组小鼠体重有上升趋势，其中乌药1g/kg组第6周差异有统计学意义（P＜0.01）；其余各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比，ALI小鼠肝脏指数显著增大（P＜0.05）；与模型组比，不同剂量乌药组小鼠肝脏指数差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 1。

图1 不同剂量的乌药醇提取物对ALI小鼠体重（A）以及肝脏指数（B）的影响。

2.2 对模型小鼠肝功能指标的影响 与正常组比较，自第2周起，ALI小鼠血清ALT、AST活性随着造模时间的延长而显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，自造模第4周起，不同剂量乌药醇提物均能有效降低模型小鼠ALT、AST活性，其中ALT以2g/kg、1g/kg、 0.2g/kg的乌药组作用较为显著（P＜0.05），0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg在6周后降低AST活性明显（见图 2）。

图2 不同剂量的乌药醇提取物对ALI小鼠肝功能指标的影响

2.3 对模型小鼠血脂水平的影响 与正常对照组比较，ALI小鼠血清TC、HDL-C随着造模时间的延长而逐渐降低趋势。TG水平在2、4周中有上升趋势，在第6周后有所下降，但差异无统计学意义。与模型组比较，不同剂量乌药组间差异无统计学意义（见图3）。

图3 不同剂量的乌药醇提物对ALI小鼠血脂水平的影响

2.4 对模型小鼠血清炎症因子水平的影响 在造模第4、6周，ALI小鼠与正常组小鼠相比血清IL-6、IL-1β水平均升高（P＜0.01）；用药组与模型组比，在第4、6周，不同剂量乌药均能降低ALI小鼠血清IL-6水平（P＜0.01），其中，以1g/kg、0.1g/kg剂量组在第4周作用相对显著。以2g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg乌药醇提物能降低IL-1β水平（P＜0.01），其中，以第6周0.5g/kg乌药醇提物最为明显。4g/kg、1g/kg乌药醇提物对IL-1β水平有上升作用（见图4）。

图4 不同剂量乌药醇提物对ALI小鼠血清炎症因子水平的影响

3 讨论

在以往的研究过程中可知酒精性肝损伤中存在脂代谢紊乱和转氨酶活性改变，血清ALT、AST活性及TG、HDL-C水平是急慢性酒精性肝损伤的敏感观察指标［5-6］。慢性酒精性肝损伤中，ALT、AST等动态指标水平的高低直接反映肝损伤的程度，为诊断和用药提供方便。在本实验中，模型小鼠血清在2、4、6周后血清ALT、AST都呈现出上升的趋势，给予不同剂量乌药醇提物干预4周后，能不同程度降低ALT、AST水平，其中以1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg乌药组降低ALT、AST水平较为明显。模型小鼠血清TC、HDL-C水平在造模第2周后下降；血清TG水平呈现先升后降变化，提示模型小鼠存在脂质代谢紊乱现象。在实验后期，0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg乌药醇提物组显示拮抗HLD-C下降作用，提示这三个剂量乌药醇提取物对酒精性肝损伤的后期有调节作用。

过量酒精摄入产生的肠源性内毒素可活化NF-κB炎症信号通路，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症介质产生，促进酒精性肝损伤的发生和进展［7-8］。在本实验中，模型小鼠的IL-1β、IL-6水平在第4周后，呈递增的趋势；与模型组比较，不同剂量乌药组均能降低IL-6水平，其中1g/kg组在4、6周较为明显，0.1g/kg组在4周时较为显著。2g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg乌药醇提物组能降低IL-1β水平，其中以0.5g/kg乌药醇提物组最为显著。

综上所述，乌药醇提取物具有抗慢性肝损伤的作用，但不同剂量乌药醇提物对慢性肝损伤的侧重点、强度和时间上有所侧重。深入系统的成分结合药效，有助于进一步研究乌药对酒精性肝损伤的作用与药效成分，促进临床药品的研发。

［1］ 中国药典委员会.中华人民共和国药典2015版. 中国医药科技出版社,北京. 2015:138.

［2］ 陈伟民, 王军伟, 朱玮华. 乌药提取物对大鼠急性酒精性肝损伤预防作用的抗氧化机制研究. 中国医刊, 2013, 48(1).

［3］ 陈卓亮, 王军伟, 谭明明,等. 乌药不同提取部位对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究. 浙江中医杂志, 2014, 49(7):538-539.

［4］ 聂子文, 郭建生, 陈君, 等. 乌药不同提取部位对小肠推进, 胃排空的影响. 中药药理与临床, 2011, 27(2): 93-95.

［5］ 赵敏,黄俊明,谭剑斌,等. 小鼠急性酒精性肝损伤模型的动态研究. 毒理学杂志,2010,24(5):378-380.

［6］ 刘明,陈绍红,钟赣生,等.葛花枳椇子配伍对酒精性肝损伤大鼠肝脏功能及病理形态的影响.南京中医药大学学报,2015,31(2):147-151.

［7］ Petrasek J,Mandrekar P,Szabo G.Toll-like receptors in the pathogenesis of alcoholic liver disease. Gastroenterol Res Pract,2010:70-80.

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