高压氧对FVB小鼠高架十字迷宫行为的影响

罗朝文 成金玲 张楚瑜 萧丹贤 冯嘉欣 陈盛强 沈岩松 胡 楠 黄梅秀

高压氧(hyperbaric oxygenation，HBO)治疗是一种常见临床治疗手段，指机体处于高气压环境中呼吸纯氧或高浓度氧, 以达到治疗疾病目的的一种治疗方法。高压氧常用于冠心病[1]，炎症性肠病[2]，急性脑梗死[3]和颅脑损伤[4]等众多临床疾病的治疗，而随着进一步的临床实践发现，高压氧疗法对老年痴呆[5]、孤独症[6]等患者的脑功能的恢复和改善也能取得良好的疗效。

人与动物的行为是在中枢神经系统控制下的极其复杂的过程，这一过程起始于内外环境的变化作用于相应感觉器官，个体往往会通过外在动作、行为和情绪表现出这种变化。生活环境条件的改变或受到外界环境的刺激后，人与动物会在中枢神经系统控制下，做出一系列的如向性、趋性、反射、本能、学习和推理等行为反应。

在临床实验方面，Rossignol，hungpaibulpatana等人[7-9]证明高压氧疗法与现有一些治疗方法相结合能普遍提高孤独症患儿的社会功能；唐龙冲等[5]证明高压氧治疗有助于改善血管性痴呆患者认知行为；动物实验方面，徐晓虹等发现高压氧也能改变昆明小鼠[10]、Wistar大鼠[11]的一些行为学实验的表型，但高压氧对FVB品系小鼠高架十字迷宫行为影响目前尚未报道。因此为进一步明确高压氧对于小鼠高架十字迷宫行为的影响，本实验对4周龄FVB129 小鼠进行高压氧干预后，再进行高架十字迷宫行为观察，尝试为进一步开展高压氧影响神经系统生理机制的研究提供行为学实验的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 4周龄FVB129近交系小鼠(荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心Oostra BA教授惠赠)，广州医科大学实验动物中心饲养及繁殖，所有小鼠均遵循人道原则和广东省及广州医科大学实验动物管理饲养条例的要求进行饲养及操作。

1.1.2 高压氧干预设备 NG90IIIB型单人医用高压纯氧舱广州医科大学附属第二医院康复科提供。

1.1.3 十字高架迷宫材料 高架十字迷宫(自制):两条两侧有挡板围蔽的闭臂和两条两侧没有挡板围蔽的开臂互相垂直成“十”字型交叉，装置离地面50 cm，每条臂均长30 cm、宽5 cm，闭臂挡板高15 cm，每条臂底部均涂黑。

1.1.4 动物行为分析软件 Smart v2.5.21(西班牙Panlab公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及高压氧处理 实验使用30日龄FVB129近交系小鼠分成两组：高压氧组和对照组。高压氧组小鼠处理方案为采用单人医用高压纯氧舱进行高压氧干预，每次干预前用纯氧洗舱10 min，然后逐渐加压20 min至2.0ATA,稳压维持40 min, 期间持续纯氧通风，氧流量维持5 L/min，舱内氧浓度在95%以上，舱内温度在20～25 ℃，随后减压10 min至1。OATA出舱, 1次/天,10天一个疗程，中间间隔1天，再进行第2个疗程。对照组小鼠置于笼内，不做任何特殊处理，单纯饲养21天。两个疗程的高压氧干预结束后立刻对两组小鼠进行高架十字迷宫行为学实验。

1.2.2 高架十字迷宫 实验开始前确认装置无上次实验留下的小鼠的粪便，是清洁、无味道的。将小鼠提前3小时左右安置于行为学实验室适应环境，减少小鼠紧张。把高架十字迷宫放在光线充足的地方，在开臂与闭臂接合处上方安置好摄像机, 并与计算机记录系统相联接，调整好录像画面。实验开始时将小鼠从笼内取出，背向实验者，头朝开臂放入开臂与闭臂结合处。小鼠进入开臂与闭臂结合处后开始计时，让小鼠在迷宫中自由活动，使用Smart v2.5.21软件跟踪小鼠活动轨迹并记录下小鼠在高架十字迷宫中5 min 的行为表现。实验结束后将小鼠放回笼内，用75%乙醇擦洗1遍迷宫并待乙醇挥发干净，防止残留气味干扰下一次的实验结果，用软件分析录像。观察指标：①进入闭臂次数(Close arm Entry，CE)，进入到任一闭臂的次数，以小鼠四个爪子均进入臂内为准，中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成; ②进入开臂次数(Open arm Entry，OE)，进入到任一开臂的次数，以小鼠四个爪子均进入到臂内为准，中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成;③闭臂停留时间(Close arm Time，CT)，单位: 秒; ④开臂停留时间(Open arm Time，OT)，单位: 秒; ⑤进入闭臂路程(Close arm Tracking，CTR) ; ⑥进入开臂路程(Open arm Tracking，OTR) 。由①～⑥分别计算出：进入开臂和封臂的总次数(OE+CE)；进入开臂次数比例(OE%)，即OE/(OE+CE)×100%；进入闭臂次数比例(CE%)，即CE/(OE+CE)×100%；开臂停留时间比例(OT%)，即OT/(OT+CT)×100%；闭臂停留时间比例(CT%)，即CT/(OT+CT)×100%；进入开臂路程比例(OTR%)，即OTR/(OTR+CTR)×100%；进入闭臂路程比例(CTR%)，即CTR/(OTR+CTR)×100%。

图1 高架十字迷宫试验

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠进入不同臂的次数

高压氧组小鼠闭臂进入次数及进臂总次数较对照组小鼠显著增加(P<0.05)。两者开臂进入次数无明显差异(P>0.05)；开臂进入次数占总进臂次数百分比与闭臂进入次数占总进臂次数百分比，两者之间无明显差异(P>0.05)。

表1 小鼠进入不同臂的次数 次)

注：1)与对照组比较有显著差异，P<0.05

2.2 小鼠在不同臂的运动路程及总路程

与对照组相比较，高压氧组小鼠在开臂的路程显著减少(P< 0.05)，在闭臂的路程显著增加(P< 0.05)，开臂总路程与闭臂总路程两者无明显差异(P>0.05)；高压氧组小鼠的开臂路程占总路程百分比显著小于对照小鼠的开臂路程占总路程百分比(P< 0.05)，高压氧组小鼠的闭臂路程占总路程百分比显著大于对照小鼠的闭臂路程占总路程百分比(P< 0.05)。

高压氧组(n=9)对照组(n=13)OTR472.89±380.121)1 549.89±947.39CTR3 412.29±837.771)2 568.35±631.36OTR+CTR3 885.18±680.044 118.23±903.22OTR/ OTR+CTR(%)12.78±10.681)36.06±17.01CTR/ OTR+CTR(%)87.22±10.681)63.94±17.01

注：1)与对照组比较有显著差异，P<0.05

2.3 小鼠在不同臂的停留时间

高压氧组小鼠的开臂停留时间显著小于对照小鼠的开臂停留时间(P< 0.05)，高压氧组小鼠的闭臂停留时间显著大于对照小鼠的闭臂停留时间(P< 0.05)；高压氧组小鼠的开臂停留时间占各臂总停留时间百分比显著小于对照小鼠的开臂停留时间占各臂总停留时间百分(P< 0.05)，高压氧组小鼠的闭臂停留时间占总停留时间百分比显著大于对照小鼠的闭臂停留时间占总停留时间百分比(P< 0.05)。

高压氧组(n=9)对照组(n=13)OT39.88±28.231)97.00±57.62CT164.48±33.961)118.13±48.98OT/OT+CT(%)19.79±14.181)43.72±18.99CT/ OT+CT(%)80.21±14.181)56.28±18.99

注：1)与对照组比较有显著差异，P< 0.05

注：A对照组；B高压氧组(其中上、下为开臂区域,左、右为闭臂区域)

3 讨论

动物行为学是研究动物的行动举止的科学。它不仅包括明显的运动如行走跑跳和飞翔等，也包括一些身体局部的细微反应如注目、竖耳、立毛、发声、变色、释放 气味等。本能行为、学习行为、母性行为、探究行为、性行为、群体的社会行为以及行为的生理机制和遗传发育规律等都是动物行为学的主要研究内容。个体动物的行为表现既由先天所决定，又受后天经验的左右。本能是遗传贮存在中枢神经系统中的固定行为模式，而学习能通过经验或练习使行为发生比较持久的临时改变，原有的天赋不足以应付，需用学习来修正行为反应以达到适应。行为学研究的深入，使人们更加了解动物以及它们与环境的相互作用。因此人们通过各种各样的实验方法的设计，从行为学、脑成像、电生理、组织化学及分子生物学角度试图分析动物的认知过程，意向过程及人的人格和个性。其中认知过程包括了感觉、直觉、注意、学习、记忆和思维，意向过程包括情绪、情感、动机、意向、意志及意志行为等。虽然动物行为学实验不能反映微观机制，但能观察多因素混合作用对动物的综合影响，可以反映动物整体状态。尽管实验医学的研究不断应用各种先进的科技手段，从宏观到微观，从整体到局部，从行为到基因，不同层次的研究广泛展开，而动物行为学依然是研究者评估动物神经系统变化的主要指标。

行为学评估的内容有很多方面，主要包括动物的自主行为、肌力及协调运动能力、学习与记忆能力等，而高架十字迷宫是评价啮齿类动物焦虑反应的重要实验方法[12]。小鼠既有面对新事物想去探究的好奇心, 又有嗜暗的天性, 高悬的高架十字迷宫开臂如同悬崖, 易导致小鼠产生恐惧，不安。利用动物对新异环境的探究特性和对高悬开放臂的恐惧心理，形成动物的矛盾冲突状态，反映动物的焦虑情绪[13]。通过比较小鼠在开臂和闭臂内的滞留时间和路程来评价小鼠的焦虑行为，进臂总次数与进入闭臂次数可以整体评价小鼠的活跃程度；小鼠进出各区域活动的时间和路程反映小鼠对环境的探索及兴奋程度，小鼠走动的路程越多，说明小鼠的探索行为越多，兴奋性越强[14- 15]。本实验的高架十字迷宫行为实验数据采集采用摄像机拍动物活动的录像，结合计算机记录、分析系统，用SMART v2.5.21软件分析录像来处理数据，比以往人工观察更加客观，灵敏。本实验采用的计算机图像分析技术能动态分析动物在高架十字迷宫的活动轨迹，可以客观提取定量数据，可以更加全面地评价动物活动特点，并为病理状态的分析提供了有用的基础。

我们实验结果表明，高压氧能改变FVB小鼠高架十字迷宫行为的表型。其中，高压氧组小鼠进入闭臂次数及进臂总次数较对照组小鼠显著增加(P<0.05)，说明高压氧组小鼠活力增加。与对照组相比较，高压氧组小鼠在开臂的路程、开臂路程占总路程百分比、开臂停留时间及开臂停留时间占各臂总停留时间百分比都显著减少(P<0.05)；而在闭臂的路程、闭臂路程占总路程百分比、闭臂停留时间及闭臂停留时间占总停留时间百分比都显著增加(P< 0.05)，开臂总路程与闭臂总路程两者无明显差异(P> 0.05)，说明高压氧组小鼠兴奋性不变，对环境的认知能力增强，对危险情况意识增强，焦虑感增加，小鼠会主动选择“安全”闭臂，避开高悬“危险”的开臂。综上所述，经过高压氧干预的小鼠高架十字迷宫的行为的改变都更符合小鼠的天性，这可能更有利于其在自然界的生存。

以往的实验证明高压氧有增加血浆溶解氧， 从而增加脑组织的氧供的作用[16]，刘仕成等人[17]证实高压氧可以降低细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 的水平，对外周及中枢神经系统起抗炎作用从而改善孤独症大鼠的生长发育及社会行为；高压氧治疗对下调Nogo-A及NgR表达是促进中枢神经再生的机制之一[18]；徐淳等证实间歇高压氧暴露可以促进小鼠脑组织中Prx 6的含量增加，从而增强组织的抗氧化能力[19]；赵宏等人[20]证实高压氧治疗可有效改善缺氧缺血性脑病新生儿的氧化应激状态及脑血流状态；刘岱等人[4]证实高压氧可以有效减轻氧化应激损伤和炎症反应,改善重型颅脑损伤患者血管内皮细胞功能,降低颅内压。所以本实验中高压氧干预改变正常生理状态下FVB小鼠高架十字迷宫行为的表型,可能与其促进脑组织的有氧代谢和能量合成,使脑组织获得更丰富的营养物质,使神经细胞内的酶活性增强,降低氧自由基、炎症因子,进而保护脑组织细胞功能有关。

齐玲等人[21]在2.3ATA， 2.5ATA和2.8ATA不同的高压氧治疗压力急性一氧化碳中毒疗效观察中发现2.8ATA首次治疗压力可缩短中重度急性一氧化碳中毒的促醒时间,减少迟发性脑病的发生,提高治愈率；陈玉燕等人[22]在1.8ATA， 2.0ATA和2.2ATA不同压力高压氧对实验性脑出血大鼠出血灶周围水肿及水通道蛋白4表达的影响研究中发现2.0ATA压力治疗效果优于1.8ATA及2.2ATA，而临床实验证明较长时间吸入 60-200 kPa 的氧气，会导致肺型氧中毒，吸入 200 kPa 以上的氧气会导致惊厥型氧中毒[23]，提示临床应用中在高压氧的安全压力范围内应该还存在最有效压力。

行为学实验受温度、光照、噪音及操作人员气味等影响因素较多，在不同实验室的结果可能有较大差异。近年来，随着计算机技术的发展，高架十字迷宫实验结合计算机数字化采样和分析技术，可自动记录小鼠自发活动的全过程，并分析其运动轨迹，得到一系列行为学指标，使实验更加高效、客观。过去通过目测小鼠在高架十字迷宫里的活动过程研究小鼠行为学的传统方法，只能够计算小鼠在高架十字迷宫里进入各个区域的次数，无法记录小鼠的活动轨迹，更无法目测小鼠的行动速度、路程，而且也会因目测者主观因素而产生很大的误差，达不到满意的空间分辨率或时间分辨率。本实验采用计算机图像分析技术自动识别小鼠的运动轨迹，并结合了计算机记录、分析系统，较以往主观定性人工观察方法更加客观、灵敏，可以提取客观定量数据，可以更加全面地评价小鼠高架十字迷宫活动特点，为下一步的研究提供了有用的基础。高压氧对FVB小鼠高架十字迷宫行为影响的作用机制还值得进一步探讨。

[1] 郭晓玲. 高压氧联合药物治疗慢性心功能不全36例[J]. 武警医学, 2016，27(03):292-294.

[2] 陈 晨. 高压氧治疗炎症性肠病的新进展: 亚太潜水与高气压医学学术会议暨第二届海峡两岸高压氧医学学术会议、中华医学会第二十二次全国高压氧医学学术会议论文集[C]. 青岛：中华医学会，2013.

[3] 刘兰兰, 徐亚林, 王 峰, 等. 高压氧对急性脑梗死患者血清SOD的影响[J]. 现代医院, 2016，16(02):184-187.

[4] 刘 岱, 杨虎银. 高压氧对重型颅脑损伤患者血清炎性因子、氧化应激、内皮素及颅内压的影响[J]. 海南医学院学报, 2017，23(05):651-654.

[5] 唐龙冲, 郑湛云, 李新鸿, 等. 高压氧对血管性痴呆患者认知的影响研究[J]. 中国医药指南, 2013(13):92.

[6] 蒋 念,龚 尧, 杨小明, 等. 高压氧治疗儿童孤独症的新进展[J]. 现代预防医学, 2014,41(04):686-689.

[7] ROSSIGNOL D A, ROSSIGNOL L W, SCOTT S, et al. Hyperbaric treatment for children with autism: a multicenter, randomized, double-blind, controlled trial[J]. Bmc Pediatrics, 2009,9(1):21.

[8] CHUNGPAIBULPATANA J, SUMPATANARAX T, THADAKUL N, et al. Hyperbaric oxygen therapy in Thai autistic children.[J]. J Med Assoc Thai,2008,91(8):1232-1238.

[9] STEPAN M, JILL J S, W R L, et al. The effects of hyperbaric oxygen therapy on oxidative stress, inflammation, and symptoms in children with autism: an open-label pilot study[J]. BMC Pediatrics, 2007,7(1):36.

[10] 徐晓虹, 郭 丹, 章子贵, 等. 高压氧对小鼠学习记忆及脑细胞形态结构的影响[J]. 心理学报, 2000,32(1):91-94.

[11] 麦乃铿. 高压氧治疗对慢性应激大鼠的影响[D]. 广东：南方医科大学, 2015.

[12] WALF A A, FRYE C A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents[J]. Nature Protocols, 2007,2(2):322.

[13] ROY V, CHAPILLON P, JELJELI M, et al. Free versus forced exposure to an elevated plus-maze: evidence for new behavioral interpretations during test and retest[J]. Psychopharmacology, 2009,203(1):131-141.

[14] 赵玉堂. 黄连阿胶汤对高架十字迷宫焦虑大鼠模型的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012，18(20):281-282.

[15] 庞婕. 黄连活性物质的抗焦虑作用及其机理研究[D]. 重庆：西南大学, 2014.

[16] 岳增文, 孔德钦, 徐莉. 高压氧舱在缺氧性疾病中的应用进展[J]. 中国疗养医学, 2013，22(08):675-678.

[17] 刘仕成, 贾飞勇, 徐乃军, 等. 高压氧对孤独症大鼠行为及外周血IL-1β、IL-6和IL-10水平的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2015(01):37-40.

[18] 涂杳然,牛凡,洪德全,等.高压氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后Nogo-A及NgR表达的影响[J].中国当代医药,2017,24(33):7-9.

[19] 徐 淳,李润平.间歇高压氧暴露对小鼠肺、脑组织中抗氧化蛋白Peroxiredoxin6含量的影响[J].中国医药导报,2016,13(6):18-21.

[20] 赵 宏, 霍晓慧, 裴怀腾. 高压氧治疗对新生儿缺氧缺血性脑病氧化应激状态及脑血流的影响[J]. 实用临床医药杂志, 2016，20(17):85-87.

[21] 齐 玲, 刘天荣, 柳文萍, 等. 3种不同的首次高压氧治疗压力在急性一氧化碳中毒中的疗效观察[J]. 新疆医科大学学报, 2016，39(08):989-991.

[22] 陈玉燕, 李红玲, 牛蕾蕾, 等. 不同压力高压氧对实验性脑出血大鼠出血灶周围水肿及水通道蛋白4表达的影响[J]. 中国康复医学杂志, 2013，28(05):413-417.

[23] 曹淑云, 常英华, 王永霞. 重视氧中毒的临床表现分型与护理要点[J]. 世界最新医学信息文摘, 2017(83):251.