肇庆地区β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变分析

陈雄毅，岑丽莲，梁文静

(广东省肇庆市第一人民医院检验科 526040)

珠蛋白生成障碍性贫血为常染色体隐性遗传病，主要分为α-、β- 2种类型[1]。遗传后代不分男、女性，概率均等[2]。β-珠蛋白生成障碍性贫血是由于β-珠蛋白链合成减少或完全不能合成所致，其基因突变类型有明显的地域性，是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。肇庆地区处于广东中西部，为广东省内占地面积最大的城市，人口众多。该院为肇庆地区第一家开展珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断的医疗机构，除发现广东常见的CD41-42(-77CT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)等，还发现了10种少见的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变。报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年5月至2017年6月该院产前检查和健康体检的肇庆地区人群，排除急慢性失血、缺铁性贫血等其他贫血，所有研究对象受检时均未输过血或者距末次输血隔间3个月以上。共7 350例检测标本，男2 546例，年龄2个月至80岁,平均年龄(32.5±18．9)岁,女4 804例,年龄2个月至82岁,平均年龄(31.5±17．2)岁。

1.2仪器与试剂 迈瑞公司BC-6800全自动血细胞分析仪及其配套试剂；法国Sebia公司Capillary毛细管电泳分析仪及其配套试剂；深圳亚能生物技术有限公司β-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测试剂盒。ABI-3730xl基因测序仪及配套BigDye Terminator试剂盒。

1.3方法 (1)血液学筛查：检测红细胞(RBC)个数、血细胞比容(HCT)、血红蛋白(Hb)、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)等；进行Hb电泳，定量测定胎儿血红蛋白(HbF)、HbA2等。贫血：Hb小于该年龄段正常值下限和(或)MCV<80 fL和(或)MCH<28 pg；Hb电泳指标：HbA2和(或)HbF大于该年龄段上限值；或Hb电泳指标阳性可定义为血液学初筛阳性。(2)β-珠蛋白生成障碍性贫血基因型检测：血液学初筛阳性者采用PCR-RDB法，同时检测17种中国人常见的β-珠蛋白生成障碍性基因突变,包括10种杂合突变[CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)、CD43(G→T)、-29(A→G)、CD31(-C)、-32(C→A)]和7种不区分型别的突变[IVS-I-1(G→T)、CD27/28(+C)、-30(T→C)、CD14-15(+G)、CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]、Int(ATG-AGG)、IVS-I-5(G→C)]。

1.4基因测序 珠蛋白生成障碍性筛查阳性而PCR-RDB法检测仍不能确诊的基因型，均进行直接基因测序。

1.5诊断标准 根据家族史、血液学筛查、基因分析、基因测序结果确定诊断为β-珠蛋白生成障碍性贫血。

2 结 果

2.1血液学筛查结果 血液学筛查7 350例标本中，阳性且HbA2和(或)HbF大于该年龄段上限值标本875例，阳性率11.9%。

2.2基因诊断结果 875例初筛阳性标本中，432例被确诊为β-珠蛋白生成障碍性贫血，其中轻型421例，重型11例。共16种突变类型，484个β-珠蛋白生成障碍性等位基因，其中462个等位基因为广东常见的基因突变类型(95.5%)；22个等位基因为少见的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变类型(4.5%)。其中19个等位基因由PCR-RDB法确定，另外3个通过基因测序确定。

表1 少见β-珠蛋白生成障碍性贫血的筛查、基因型和表型结果

表2 少见β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变类型和构成比

2.3少见β-珠蛋白生成障碍性基因结果 22例少见的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变携带者，4例为重型地贫，基因型分别为CD41-42(-TTCT)/CD43(G→T)2例，-28(A→G)/CD43(G→T)和CD41-42(-TTCT)/-29(A→G)各1例，其余18例为轻型。共检出10种少见的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变类型，包括 CD43(G→T)7例，IVS-I-1(G→T)和-29(A→G)各3例，CD27/28(+C)和CD14-15(+G)各2例，CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]、CD31(-C)、CD113(GTG→GAG)、-90(C→T)、CD37(TGG→TAG)各1例。见表1、2。

3 讨 论

目前，世界上不同种族已发现至少200种β-珠蛋白生成障碍性贫血突变类型，其中10多种为缺失型，其余均为点突变[3]。我国绝大多数β-珠蛋白生成障碍性贫血都是由于基因发生点突变所致，突变涉及基因及旁侧表达顺序的各个环节。主要类型有：(1)编码区的无义突变、移码突变、起始密码突变：如CD43(G→T)是无义突变密码子，使生成的mRNA稳定性降低或形成无功能的mRNA，从而不能合成正常的珠蛋白链而产生β0珠蛋白生成障碍性贫血。属于此种突变类型的还有CD27/28(+C)和CD31(-C)。(2)非编码区IVS1和IVS2突变：如IVS1的1位(G→T)因RNA拼接处改变，致使mRNA不能准确进行加工，形成异常mRNA，表现为β0或β+。(3)影响转录的突变：这类突变主要集中于起始位点上游的启动子TATA框，使转录效率降低，mRNA生成量减少而产生β+，-29(A→G)属于此类。(4)RNA裂解部位缺陷：与异常RNA加帽部位和多聚腺甘酸化信号的突变有关。(5)编码区的外显子突变引起剪接作用的改变：IVS正常位点剪接的改变，会产生异常mRNA。

本研究对肇庆地区1 962例筛查阳性且HbA2≥3.5和/或HbF≥2.5的标本进行基因检测，432例被确诊为β-珠蛋白生成障碍性贫血，阳性检出率22.0%，共发现16种突变类型，高于黄晓佳等[4]的11种突变类型。本研究范围和检测方法：(1)除要求研究对象的珠蛋白生成障碍性贫血筛查阳性外，还将HbA2≥3.5和/或HbF≥2.5作为纳入标准。(2)采用PCR-RDB法检测17种中国人常见的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变类型外，对不能确诊的基因突变，再使用DNA直接测序法确定。CD113(GTG→GAG)、-90(C→T)、CD37(TGG→TAG)是通过基因测序确定，且其与CD27/28(+C)、CD31(-C)是首次于肇庆地区报道的β-珠蛋白生成障碍性贫血突变类型。

由于β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变具有异质性，在不同地区的基因突变类型和所占的比例也有所不同,其少见突变类型也如此。432例被确诊为β-珠蛋白生成障碍性贫血标本中，发现10种少见的突变类型，共22个基因位点，占同期肇庆地区检出的4.55%，高于朱春江等[5]报道的桂林地区6种少见突变(2.28%)，也高于王文娟等[6]报道的江苏地区3种少见突变类型和彭兰芬等[7]报道的东莞厚街地区检出的1种少见基因型。桂林地区以IVS-I-1(G→T)基因型的构成比最高，肇庆地区检出的少见突变类型以CD43(G→T)基因型最多。-90(C→T)转录突变于2003年首次在国内报道，属于中国人的稀少突变型[8]。CD37(TGG→TAG)在国内仅有数例报告，在中国人群的突变频率无确切统计[9]。CD113(GTG→GAG)在宋春林等[10]的报道中采用β-球蛋白基因直接基因测序鉴定8例。统计肇庆地区少见β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变，不除外在该地区还有更多的人群存在以上突变的可能，其起源、携带频率等具体情况需要收集更多相关病例,然后进行深入的研究分析。

本研究检测β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变的PCR-RDB方法可以利用多重PCR，一次性扩增出包含突变位点的多个片段，并在一张膜上同时对多个突变位点进行检测，易实现检测流程的标准化[11]。但吕荣钰等[12]报道,目前常规基因检测方法可能低估了珠蛋白生成障碍性贫血及异常Hb病携带者，因此基因突变鉴定的金标准依然是DNA直接测序[13]。本研究22例少见突变类型中，3例是PCR-RDB法无法检测，必须通过基因测序确定。另外，表1数据表明，血液学筛查结果有22例少见突变类型都符合β-珠蛋白生成障碍性贫血Hb电泳的主要表现：HbF增高或者HbA2增高；1例CD43(G→T)/βN 的MCV、MCH在正常范围，与血液学参数特点不相符。临床基因检测结果应该结合血液学结果、Hb综合分析，对高度怀疑β-珠蛋白生成障碍性贫血而PCR-RDB方法未能检出的17种常见基因突变标本，通过扩增β-珠蛋白基因直接测序确定，避免漏诊、误诊。

综上所述，肇庆地区人群珠蛋白生成障碍性贫血的基因携带率较高，且有该地区的基因突变类型和基因频率分布特点。结合常规基因分析和基因测序，本研究发现10种少见β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变类型，不但补充了该地区的β-珠蛋白基因突变谱，对指导人群筛查具有重要价值，而且为临床医师在诊断、优生遗传咨询方面提供参考。

参考文献

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[12]吕荣钰，赵飞球，陈小文，等．常规基因检测阴性的地中海贫血疑似病例再行进一步基因检测仍有7%的阳性发现[J]．中国循证儿科杂志，2014,28(4)：274-277．

[13]王文娟，朱春江．地中海贫血的分子诊断技术进展[J]．华夏医学，2017，30(2)：172-176．