黄花苜蓿花药培养再生体系的建立与单倍体鉴定

徐 舶，高 霞，石凤翎，崔 楠，乌日娜

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上种植最广泛的饲料作物之一，提高苜蓿饲草产量和营养价值是苜蓿育种的主要目标[1]。利用苜蓿雄性不育系配制杂交种，可以提高种子产量，同时可利用杂种优势提高抗性，选育新品种。杂种优势育种除了双亲遗传组成的适当差异外，还要以纯合品种为前提。要进一步选育苜蓿纯合品种，仅靠常规的育种手段难以奏效，需借助花药[2]与花粉组织培养得到单倍体植株[3]，单倍体加倍后培育出双单倍体，利用双单倍体(即纯合品种)与雄性不育系配制杂交种，可获得强优势的杂交种F1代。

黄花苜蓿(M.falcate)抗逆性强，适于我国寒冷草原地区种植，具有重要的生态和经济价值[4]，适宜作为杂交组配的父本材料，因而借助花药组织培养的方式获得纯合的黄花苜蓿材料具有重要的意义。目前虽有很多关于黄花苜蓿组培体系的研究[4-8]，但组织培养体系并不完善，国内也未见获得单倍体以及双单倍体黄花苜蓿的报道。因此，本研究以呼伦贝尔黄花苜蓿(Medicagofalcate‘Hulunbeier’)为材料，建立花药组织培养的高效再生体系，鉴定出单倍体，以期为双单倍体的培养奠定基础[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与药品

试验材料为呼伦贝尔黄花苜蓿，种子由呼伦贝尔草原站提供，于2015年种植在内蒙古农业大学新校区牧草试验地。4-5月，选择处于单核靠边期(花蕾长至1～3 mm)的花蕾，将带有枝条的花序剪下装入纱网袋，带回实验室备用。

本试验所用激素均由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供，纯度均在95%以上。培养基由Chembase公司提供，蔗糖为天津大茂公司提供的分析纯试剂，琼脂由Biosharp公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1诱导愈伤组织培养基的配比 采用固体及液体悬浮培养两种培养方式。以B5为诱导花药愈伤培养基，参考前人试验结果[4,10]设置各培养基的激素配比，选用L16(44)正交表(表1)。其中固体培养加蔗糖30.0 g·L-1，琼脂7.0 g·L-1，pH 5.8。液体悬浮培养加蔗糖30.0 g·L-1，0.01 g·L-1活性炭，pH 5.8。

1.2.2固体培养基花药诱导愈伤组织方法 灭菌处理：将带有枝条的花序装入纱网袋，在流水下冲洗30 min，超净工作台中用70%酒精消毒30 s，然后用无菌水冲洗2次，0.1% HgCl2溶液消毒3 min，无菌水冲洗3次，置于无菌培养皿中待用。

表1 呼伦贝尔黄花苜蓿花药诱导愈伤组织培养正交试验的各因素水平Table 1 The level of various factors in the orthogonal test of induction callus culture of Medicago falcata ‘Hulunbeier’ anthers

接种：选择单核靠边期花蕾，消毒后用解剖针剥开花蕾，取出花药分别接种到培养基上，每个培养基上接种15个花药，各8个重复。

1.2.3液体悬浮培养基花药诱导愈伤方法 花序消毒后(消毒方法同前)，选择单核靠边期花蕾，用解剖针剥开小花蕾取出花药，接种在液体培养基中。每个培养基上接种10个花药，各6个重复。置转速110 r·min-1、25 ℃的摇床中暗培养60 d。

1.2.4愈伤组织的分化培养 固体培养和液体悬浮培养出的愈伤组织，均转入固体分化培养基继续培养。在崔楠[11]试验的基础上稍作改进，在分化培养基中添加了6-BA，分化培养基组成如表2所列，pH 5.8，蔗糖20.0 g·L-1，琼脂7.0 g·L-1。每瓶接种5块愈伤组织，各5个重复，20 d继代一次。

表2 愈伤分化培养基Table 2 Medium for shoot development

1.2.5分化苗的生根培养 以诱导出的分化苗为材料进一步筛选适宜的生根培养基，培养基组成如表3所列，pH 5.8，蔗糖20.0 g·L-1,琼脂7.0 g·L-1。

1.2.6结果观察与统计方法 固体培养从花药接种30 d后，统计出愈率；液体悬浮培养从花药接种60 d后，统计出愈率。愈伤组织增殖培养一次(30 d)后转入分化培养基，分化出绿苗后统计分化率。

表3 苜蓿花药培养植株的生根培养基Table 3 Rooting media for cultured alfalfa plants

出愈率=(产生愈伤组织块数/接种花药数)×100%;

分化率=(分化出芽点的愈伤组织数/接种愈伤组织总数)×100%;

生根率=(生根植株数/接种分化苗总数)×100%。

利用Excel软件处理基础数据，SAS(9.0)软件进行方差分析。

1.2.7倍性鉴定 通过贝克曼流式细胞仪(Beckman coulter cytoFLEX)对呼伦贝尔黄花苜蓿花药培养再生植株进行倍性鉴定。对照材料为：已知倍性扁蓿豆(Medicagoruthenica)(2n=16)无菌苗,草原1号杂花苜蓿(Medicagovaria‘Caoyuan No.1’)(2n=32)无菌苗。

前处理方法参考高霞[12]的操作过程，略有改进。样品破碎后，转速1 000 r·min-1，离心5 min。PI染色15 min。

在488 nm荧光的激发下，测定PE通道待测样的荧光强度，利用Cyt Expert软件进行分析，根据峰值位置确定所测植株的倍性。

2 结果与分析

2.1 呼伦贝尔黄花苜蓿花药组织培养出愈情况

在16个激素配比组合中，花药在液体培养条件下有56.3%的组合出愈率为0，而固体培养基下均表现出一定的出愈率(1.67%～26.67%)(表4)。A5液体悬浮培养条件下的出愈率(70.00%)明显高于A14固体培养的出愈率(26.67%)，同时，花药愈伤组织形成时间在液体培养中(60 d)较固体培养下的时间(20 d)长。

在液体悬浮培养条件下，由各激素的R值可知，对花药的出愈率影响较大的激素是2,4-D(表5)。呼伦贝尔黄花苜蓿在0.5 mg·L-12,4-D浓度下悬浮培养花药的出愈率均高于不同2,4-D浓度下固体培养花药的出愈率。综合考虑不同培养方式和激素配比的影响，呼伦贝尔黄花苜蓿花药悬浮培养的适宜条件为B5培养基+0.5 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.01 g·L-1活性炭。

表4 不同培养方式和激素配比下呼伦贝尔黄花苜蓿花药培养的出愈率Table 4 Callus induction rate in the anther tissue culture of different culture methods and hormone ratio on Medicago falcata ‘Hulunbeier’

同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表5 呼伦贝尔黄花苜蓿花药液体悬浮培养出愈率的极差Table 5 Range analysis of callus rate in the liquid culture of the anther of Medicago falcata ‘Hulunbeier’

K1、K2、K3、K4均值分别表示在4因素各水平下新鲜花药出愈率的平均值，R为同一因素各水平下出愈率均值的极差。

The means ofK1,K2,K3andK4indicate the means of callus induction rate of fresh anther of four factors at different levels.Ris the range of average callus induction rate of the same factor at different levels.

2.2 愈伤组织分化

为了探索用于愈伤组织分化的最佳激素组合和配比，将0.2 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-12,4-D分别与两个浓度水平的6-BA(0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1)进行组合(表6)。结果显示，2,4-D与6-BA的组合对呼伦贝尔黄花苜蓿愈伤组织的分化作用优于NAA与6-BA的组合。其中，2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1的组合对呼伦贝尔黄花苜蓿愈伤组织的分化诱导高达88%。

2.3 分化苗生根率

呼伦贝尔黄花苜蓿在Ⅲ号培养基下生根率(87%)显著高于其余3种培养基(表7)。同时，其分化率在0.1mg·L-1NAA的培养基下显著高于0.2 mg·L-1NAA的培养基(P<0.05)，说明相对的低浓度NAA有利于分化苗的生根培养(图1)。因此，分化苗适宜生根培养基为1/2MS培养基+0.1 mg·L-1NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂。

表6 不同培养基上呼伦贝尔黄花苜蓿愈伤组织的分化率Table 6 Callus differentiation rate in four medium types for Medicago falcata ‘Hulunbeier’

表7 不同培养基上的生根率比较Table 7 Comparison of rooting rate in the callus in four types of medium

图1 呼伦贝尔黄花苜蓿组织培养再生过程Fig. 1 Photographs of the tissue culture regeneration process in Medicago falcata ‘Hulunbeier’

2.4 再生植株倍性鉴定

采用改进后的前处理方法，转速1 000 r·min-1，离心5 min，PI染色15 min，图谱主峰明显，碎片减少(图2)。以已知倍性扁蓿豆(2n=16)无菌苗、草原1号杂花苜蓿(2n=32)无菌苗为对照(CK)进行倍性鉴定，固体培养方式下培养的再生植株(10株)均为四倍体，无单倍体(表8)；而在液体悬浮培养方式下再生植株(15株)中单倍体为27%(图3)。

表8 呼伦贝尔黄花苜蓿花药培养再生植株倍性检测结果Table 8 Result of ploidy detection of anther culture regenerative plants of Medicago falcata ‘Hulunbeier’ %

图2 前处理改进前(左)后(右)流式细胞仪鉴定图谱Fig. 2 Flow cytometry identification map before (left) and after (right) the improvement of processing

图3 呼伦贝尔黄花苜蓿花培再生植株流式细胞仪鉴定图谱Fig. 3 Flow cytometry identification map of anther culture regenerated plants

A，扁蓿豆 (2n=16)；B，草原1号杂花苜蓿(2n=32)；C，呼伦贝尔黄花苜蓿花培苗单倍体；D，呼伦贝尔黄花苜蓿花培苗四倍体。

A,Medicagoruthenica(2n=16); B,Medicagovaria‘Caoyuan No.1’(2n=32); C, Haploid ofM.falcata‘Hulunbeier’; D, Tetraploid ofM.falcata‘Hulunbeier’.

3 讨论

3.1 外源激素对苜蓿花药培养的影响

激素组合与浓度配比是诱导花药愈伤组织出愈率高低的重要影响因素[13]，以多花黑麦草特高(Loliummultiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麦草四季(L.perenne‘Four seasons’)的种子为外植体，激素组合为2,4-D +6-BA 时能明显降低组培污染率，且能分别得到65.52%和63.55%的最高愈伤组织诱导率[14]；以杂交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purureum)的种子为材料进行试验，发现种子愈伤组织分化的最佳激素组合为0.5 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-16-BA，分化率可达62.5%[15]。由此可见，生长素与细胞分裂素的合理搭配是提高花药愈伤组织诱导率和分化率的关键[16]。黄竣和姜彦秋[5]以黄花苜蓿下胚轴和子叶为材料诱导愈伤组织，发现2,4-D是诱导愈伤的关键激素[17]，激素组合为2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1时出愈率最高，2,4-D 0.2 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1时分化率最高(20%)。伊风艳等[4]选用相同的材料做外植体诱导愈伤组织，但分化培养基选用了NAA和KT的组合，得出，下胚轴是诱导愈伤及分化的最佳外植体，诱导率可达100%，分化率可达80%。本研究表明，2,4-D与6-BA对呼伦贝尔黄花苜蓿花药愈伤组织的分化率有显著的提高，激素配比为2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1时分化率达到88%，高于伊风艳等[4]、黄竣和姜彦秋[5]的结果，这与外植体及材料不同有一定的关系。

图4 呼伦贝尔黄花苜蓿花培苗单倍体和四倍体Fig. 4 Flower seeding culture haploid and tetraploid of M. falcata ‘Hulunbeier’

3.2 培养方式对苜蓿花药培养的影响

陈爱萍等[18]以液体悬浮培养的方式，通过观察小孢子的存活率和诱导率，建立了苜蓿游离小孢子培养体系，小孢子存活率达到30.1%。姚喜红等[19]采用固液培养基结合的方式建立苜蓿花药悬浮培养体系，培养液组合为NB+2,4-D 0.3 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1时悬浮细胞增殖最快。可见，不同的培养方式对苜蓿花药培养影响较大。

本研究中，呼伦贝尔黄花苜蓿花药在液体培养中60 d才形成愈伤组织，而固体培养下20 d便可形成愈伤组织，说明不同培养方式下花药愈伤组织形成时间不同[20]，固体培养较液体悬浮培养下花药愈伤组织形成时间短[21]。虽然液体悬浮培养花药愈伤组织形成周期较长，但在花药培养中单倍体植株出苗的频率增高，在培育过程中，液体悬浮培养下单倍体比例(27%)高于固体培养条件下的单倍体比例(0)。高霞[12]在固体培养下苜蓿花培苗单倍体所占比例(16%)低于本研究结果，这可能是因为液体悬浮培养可以使花药充分接触培养基，提供花药愈伤组织形成所需的养分，并且摇床震荡可以在培育过程中使花粉散落出来形成花粉愈伤组织，提高单倍体比例，同时固体培养条件下单倍体比例的差异可能是由材料不同即基因型不同所致。

3.3 前处理对再生植株倍性鉴定的影响

倍性鉴定是单倍体育种的关键环节，是构建双单倍体的基础[22]。花药培养得到不同倍性的植株只有经倍性鉴定后才能进行下一步的育种研究。通过流式细胞测定法进行倍性鉴定可以缩短鉴定时间[23]，但不同的测定部位、前处理方法对结果图谱影响很大[24]。耿小丽等[25]利用流式细胞仪对苜蓿愈伤组织DNA含量进行测定，由于愈伤组织结构较松散，所以图谱虽主峰明显但有效细胞数较少。高霞[12]通过二步离心法鉴定苜蓿花培再生植株倍性，所得图谱杂峰较多，这是由于前处理时间过长造成的。本研究选取再生植株的幼嫩叶片，采用一步离心法，转速1 000 r·min-1，离心5 min，同时缩短PI染色时间(15 min)[26]，可以有效减少碎片和粘连的影响，主峰值明显，有效细胞数量多，也可避免DNA的降解和PI染液的分解，图谱清晰。

4 结论

1)呼伦贝尔黄花苜蓿花药组织培养适于液体悬浮培养，其愈伤形成的培养条件为B5+0.5 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-1KT；分化培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.7%琼脂；生根培养基为1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂。

2)利用流式细胞仪鉴定再生植株倍性时，应选择幼嫩的叶片，同时缩短前处理时间，可较为准确地鉴定出组织的染色体倍性；液体悬浮培养再生植株中单倍体占27%。

参考文献References:

[1] Sakiroglu M,Brummer E.Identification of loci controlling forage yield and nutritive value in diploid alfalfa using GBS-GWAS.Theoretical & Applied Genetics,2017,130(2):1-8.

[2] Mori S,Adachi Y,Horimoto S,Suzuki S,Nakano M.Callus formation and plant regeneration in variousLiliumspecies and cultivars.In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant,2005,41(6):783-788.

[3] Zagorska N,Robeva P,Dimitrov B,Shtereva R,Gancheva V.Induction of regeneration in anther cultures inMedicagosativaL.Dokladi Na Bolgarskata Akademiya Na Naukite,1984,37(8):1099-1102.

[4] 伊风艳,石凤翎,展春芳,姜圆圆.黄花苜蓿愈伤组织诱导及分化培养条件的研究.中国草地学报,2011,33(6):14-20.

Yi F Y,Shi F L,Zhan C F,Jiang Y Y.Study on culture conditions for callus induction and differentiation ofMedicagofalcata.Chinese Journal of Grassland,2011,33(6):14-20.(in Chinese)

[5] 黄竣,姜彦秋.黄花苜蓿愈伤组织诱导与植株再生.四川草原,1990(1):45-48.

Huang J,Jiang Y Q.Callus induction and plant regeneration ofMedicagofalcata.Journal of Sichuan Grassland,1990(1):45-48.(in Chinese)

[6] 刘芳,王玉祥,陈爱萍,张博.新疆野生黄花苜蓿愈伤诱导及分化的研究.草地学报,2012,20(4):741-746.

Liu F,Wang Y X,Chen A P,Zhang B.Callus induction and differentiation of XinjiangMedicagofalcataL.Acta Agrestia Sinica,2012,20(4):741-746.(in Chinese)

[7] 侯永霞,王俊杰,赵彦,云锦凤,陈雪英.野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究.草地学报,2012,20(3):524-529.

Hou Y X,Wang J J,Zhao Y,Yun J F,Chen X Y.Tissue culture and regeneration system of nativeMedicagofalcataL.Acta Agrestia Sinica,2012,20(3):524-529.(in Chinese)

[8] 黄竣,奚惕,姜彦秋.黄花苜蓿游离细胞培养的初步研究.草业科学,1989,6(6):48-51.

Huang J,Xi T,Jiang Y Q.A primary study on the suspension culture of the isolated cells fromMedicagohispida.Pratacultural Science,1989,6(6):48-51.(in Chinese)

[9] Gu H H,Zhou W J,Hagberg P.High frequency spontaneous production of doubled haploid plants in microspore cultures ofBrassicarapassp.chinensis.Euphytica,2003,134(3):239-245.

[10] 唐伟，尹思明，玉永雄.紫花苜蓿花药培养的研究进展.安徽农业科学,2012,40(9):5255-5258.

Tang W,Yi S M,Yu Y X.Advances of alfalfa anther culture technology.Journal of Anhui Agricultural Science,2012,40(9):5255-5258.(in Chinese)

[11] 崔楠.3种苜蓿花粉组织培养与单倍体鉴定.呼和浩特:内蒙古农业大学硕士学位论文,2017.

Cui N.Pollen culture of the three alfalfa varieties and its haploid identification.Master Thesis.Huhhot:Inner Mongolia Agricultural University,2017.(in Chinese)

[12] 高霞.苜蓿花药培养与雄性不育差异表达分析.呼和浩特:内蒙古农业大学博士学位论文,2012.

Gao X.Study on the anther culture and male sterility differential expression analysis of alfalfa.PhD Thesis.Huhhot:Inner Mongolia Agricultural University,2012.(in Chinese)

[13] 阳宴清,王咏,朱美兰,卢运海.芦竹愈伤组织诱导及再生体系的建立.草业科学,2016,33(7):1332-1341.

Yang Y Q,Wang Y,Zhu M L,Lu Y H.A study on callus induction and plant regeneration in giant reed (Arundodonax).Pratacultural Science,2016,33(7):1332-1341.(in Chinese)

[14] 曾庆飞,韦鑫,陈锡,陈光洁,马培杰,吴佳海,王小利.多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立.草业科学,2017,34(8):1649-1660.

Zeng Q F,Wei X,Chen X,Chen G J,Ma P J,Wu J H,Wang X L.Optimisation and establishment of a high frequency regeneration system forLoliummultiflorum‘Tetragold’ andL.perenne‘Four seasons’.Pratacultural Science,2017,34(8):1649-1660.(in Chinese)

[15] 臧文静,陈莹,李青,苟孝琴,武炳超,杨盛婷,张锐,张新全,黄琳凯.杂交狼尾草不同外植体愈伤组织诱导.草业科学,2015,32(9):1451-1456.

Zang W J,Chen Y,Li Q,Gou X Q,Wu B C,Yang S T,Zhang R,Zhang X Q,Huang L K.Tissue culture differentiation and callus induction of different explant fromPennisetumamericanum×P.purureum.Pratacultural Science,2015,32(9):1451-1456.(in Chinese)

[16] 唐懿.苦瓜花药培养及培养过程中内源激素研究.雅安:四川农业大学博士学位论文,2011.

Tang Y.Anther culture and endogenous hormone concentrations in bitter melon (MomordicacharantiaL.).PhD Thesis.Ya’an:Sichuan Agricultural University,2011.(in Chinese)

[17] 黄远新,玉永雄,胡艳.南方紫花苜蓿不同外植体离体培养研究.中国草地,2003,25(3):42-47.

Huang Y X,Yu Y X,Hu Y.Tissue culture of different explants of alfalfa cultivated in southern China in vitro.Grassland of China,2003,25(3):42-47.(in Chinese)

[18] 陈爱萍,王玉祥,张晶,张博.不同处理对苜蓿小孢子离体培养存活率的影响.新疆农业科学,2013,50(6):1150-1156.

Chen A P,Wang Y X,Zhang J,Zhang B.Effects of survival rate of alfalfa microspore culture by different treatments.Xinjiang Agricultural Sciences,2013,50(6):1150-1156.(in Chinese)

[19] 姚喜红,魏臻武,耿小丽.苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素.草地学报,2010,18(3):358-364.

Yao X H,Wei Z W,Geng X L.Establishment of alfalfa anther suspension culture system and the influencing factors.Acta Agrestia Sinica,2010,18(3):358-364.(in Chinese)

[20] 朱献文,龚义勤,柳李旺,黄丹琼,赵艳玲,汪隆植.萝卜花药愈伤组织诱导与分化影响因素的研究.生命科学研究,2007,11(1):90-94.

Zhu X W,Gong Y Q,Liu L W,Huang D Q,Zhao Y L,Wang L Z.Study on factors affecting the induction and differentiation of anther callus in radish.Life Science Research,2007,11(1):90-94.(in Chinese)

[21] 柴卫淑,谭学林,师佳,陈联秀.液体培养基在水稻花药培养中的应用研究.中国农学通报,2004,20(4):145-146,157.

Chai W S,Tan X L,Shi J,Chen L X.Application of liquid medium for anther culture in rice.Chinese Agricultural Science Bulletin,2004,20(4):145-146,157.(in Chinese)

[22] Daniele R,Nicoletta F,Stefano A,Stefano C,Elisa D Z,Paola L,Bachir B,Riccardo A,Domenico C,Lara R,Fabio V.Sexual polyploidization inMedicagosativaL.:Impact on the phenotype,gene transcription,and genome methylation.G3:Genes,Genomes,Genetics,2016,6(4):925-938.

[23] Carloni E, Ribotta A,Colomba E L.Somatic embryogenesis from in vitro anther culthre of apomictic buffel grass genotypes and analysis of regenerated plants using flow cytometry.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2014,117(3):311-322.

[24] 刘倩,魏臻武.流式细胞术分析苜蓿相对DNA含量的样品处理方法.草业科学,2014,31(9):1718-1723.

Liu Q,Wei Z W.Sample preparation for alfalfa relative DNA content analysis by flow cytometry.Pratacultural Science,2014,31(9):1718-1723.(in Chinese)

[25] 耿小丽,魏臻武,姚喜红.采用流式细胞仪鉴定紫花苜蓿花药愈伤组织的变异.草业学报,2011,20(3):156-161.

Geng X L,Wei Z W,Yao X H.Genetic variation ofMedicagosativacallus revealed by the ploidy analyser.Acta Prataculturae Sinica,2011,20(3):156-161.(in Chinese)

[26] Eaton T D,Curley J,Williamson R C,Jung G.Determination of the level of variation in polyploidy among Kentucky bluegrass cultivars by means of flow cytometry.Crop Science,2004,44(6):2168-2174.