肉鸡大肠杆菌的分离鉴定

文│曹民川 周丽梅 唐振兴（陕西省铜川市动物疫病预防控制中心）

本研究以陕西省铜川市某养殖场疑似肉鸡大肠杆菌病的病鸡为研究对象，采集其肝脏、脾脏等组织作为病料，进行细菌的分离培养以及生化鉴定、血清型鉴定，并进一步进行了药敏试验。试验结果表明，分离获取的40株分离株均为大肠杆菌，分离率为66.67%，其血清型分别为O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株）。药敏试验结果显示：分离株对环丙沙星高敏；对卡那霉素、红霉素中敏；对青霉素、链霉素、庆大霉素低敏。因此，环丙沙星可以作为该养鸡场预防和治疗鸡大肠杆菌病的药物，其他抗生素可以减少其使用量或停用。

当机体的抵抗力下降或者外界的环境发生改变有一部分大肠杆菌成为致病菌株，达到了致病性大肠杆菌生长发育的条件，大肠杆菌数量增多，就会乘虚而入侵入动物肠道内并在合适的位置定居，生长繁殖。临床上以出现心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、眼球炎及肉芽肿、败血症等为特征。大肠杆菌可以通过饲料、水、空气等进行传播，也可以垂直传播但容易造成死胚、弱雏增多，使养禽业受到打击。大肠杆菌病是养鸡业最严重的常见多发病，尤其是3～6周龄的雏鸡容易感染，且在临床中多以混合感染，从而难以治愈，发病率高，死亡率逐步增加。该病的传染性强，传播范围广，因为大肠杆菌的血清型比较复杂，目前没有有效的疫苗可以预防。因此，该病一直以来主要用药物来进行防治，这使得耐药性越来越严重，给治疗带来一定的难度。

大肠杆菌生长的环境简单，营养的要求低，在一般的营养培养基上即可成长，温度在15～45℃，菌落直径2～3毫米，圆形，表面湿润光滑。该菌对理化要素较敏感，60℃25分钟或55℃1小时即可致死，121℃经高压灭菌迅速死亡。该菌对自然因素抵抗力较强，可在水中生存百余天，在粪便中能生存200多天，在饲料、垫草，中也可长期生存。大肠杆菌对甲醛、漂白粉敏感，但是如果存在粪便以及黏液，会很大一部分降低这些消毒剂的成效。多数禽类对大肠杆菌较为敏感，并且在感染后病情会加重，雏鸡极易发生气囊炎。感染大肠杆菌的肉鸡表现精神萎靡，体温呈上升趋势，食欲减少，消瘦和下痢，全身无力，羽毛变得疏松，呆立，伸颈闭眼，行动缓慢，其中粪便里混有少量黏液，经常导致肛门周围的羽毛受到污染。情况严重的病鸡腹部出现高度肿大，触摸敏感并伴有波动，病程能够持续两个星期或更长。

治疗大肠杆菌病首先应该改善饲养环境，及时清除鸡粪，提高室温，改善鸡舍通风的状况，利用百毒杀每天带鸡喷雾消毒2次，连续使用7天。可使用硫酸卡那霉素，按70毫克/千克体重的用量，2次/日，肌肉注射，连续使用3天，用药2天后鸡群采食量增加，症状开始出现好转，5天后鸡群开始恢复正常。

本研究对疑似肉鸡大肠杆菌病的病鸡采集其肝脏、脾脏作为病料，进行细菌的分离培养、血清型鉴定、药敏试验，为临床治疗肉鸡大肠杆菌病提供了参考。

一、材料与方法

1.材料。

（1）病料。取自铜川市某养殖场中疑似患有大肠杆菌病的病鸡，60只，3～6周龄。

（2）培养基。肉汤培养基，麦康凯培养基，普通琼脂培养基。

（3）标准O型分型血清。单因子大肠杆菌血清（购自中国兽医药品监察所）。

（4）主要仪器和设备。恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、高压蒸汽灭菌锅（山东新华医疗机械有限公司）、光学显微镜（奥林巴斯、济南）。

2.方法。

（1）临床检查。观察病鸡的精神状态、饮欲、食欲和鸡的羽毛色泽，用手触摸，给予适当的刺激观察鸡的反应。观察病鸡产蛋的情况、排泄物的黏稠程度，粪便颜色，有没有恶臭，并且查阅最近两周内鸡群的采食量的记录。

（2）剖检。首先仔细观察病鸡的表面状况，包括鸡冠和皮肤、鼻腔和嘴的分泌物及排泄物的性状、颜色，然后打开胸腔、腹腔，观察有无积液，观察黏膜、气囊的变化，各内脏器官有无出血等病变，并无菌采集病死鸡的肝脏、脾脏作为病料。

（3）病原菌的分离培养与纯化。在无菌条件下取病鸡的肝组织，脾脏组织等接种于肉汤培养基、普通琼脂培养基和麦康凯琼脂平板培养基，37℃恒温的培养箱培养23～24小时，观察结果。

（4）生化试验。选取麦康凯培养基上单一红色菌落于营养肉汤中，37℃培养17小时后，取适量的菌液，分别接种于葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘露醇、山梨醇、硫化氢、肌醇、尿素、V.P试验，37℃培养24～48小时，观察结果。

（5）血清型鉴定。抗原的制备。制备高压抗原：在普通的琼脂斜面平板上以及供大肠杆菌生长的肉汤小管里接种来自麦康凯培养基上接种被检的菌株，其中被检菌株放在37℃恒温培养箱中，培养24小时，在麦康凯培养基上形成典型的、单个的小红色菌落，进行分别接种，接种后在37℃恒温培养箱连续培养24小时，其中普通肉汤小管为液体培养基，在培养期间需要震荡。然后用约3毫升的0.5%石碳酸生理盐水冲洗琼脂斜面培养物，放置试管中，并与普通肉汤小管培养物一起放到121℃高压中2小时，破坏K抗原。

玻板凝集反应。将高压抗原和血清分别取8毫升放到玻板上混合均匀，在2～4分钟内呈现明显的凝集则为阳性反应。

（6）药敏试验。打开超净工作台，点燃酒精灯，将接种环在酒精灯上来回灼烧进行灭菌，然后挑取细菌培养物，将菌液均匀的涂布到平皿中。然后用无菌的镊子夹起药敏纸片放到固体培养基上面并轻轻按压，使药敏纸片与培养基表面全部接触。为了能够精确察看结果，药敏纸片位置安放适中，避免出现抑菌圈重叠。20分钟后再置于37℃温箱中培养18～24小时，观察结果。

二、结果

1.临床检查结果。病鸡精神萎靡，咳嗽，呼吸困难，羽毛疏松，饮欲变大，食欲减小，用手触摸，能感受到病鸡畏寒发抖，给予适当的刺激，病鸡反应停滞；产蛋率下降，蛋小、蛋壳粗糙；排黄绿色的稀粪，有酸臭味。

表1 分离细菌生化试验结果

◎图1 分离菌菌落形态（营养琼脂培养基）

◎图2 分离菌菌落形态（麦康凯培养基）

2.剖检变化。病鸡的鸡冠出现暗紫色，皮肤外表颜色暗淡、无光泽，鼻分泌物增加；解剖病鸡可见腹腔内有大量的腹水；直肠肠管的黏膜以及泄殖腔黏膜呈现弥漫性的针尖状出血，气囊变厚，出现混浊；肝脏变得肿大，外表笼罩一层点状黄白色纤维性膜，表面有大小不等的坏死斑。

表2 40株分离菌血清型鉴定结果

表3 大肠杆菌药敏试验结果

3.病原菌的分离与纯化。待分离菌在营养琼脂培养基上生长24小时后，形成乳白色菌落，在麦康凯培养基上形成红色菌落，如图1、图2。分离菌经过涂片、染色、镜检，形成革兰染色阴性短粗杆菌无可见的荚膜，具有典型的大肠杆菌的染色特及形态，如图3。

4.生化试验结果。从分离培养的细菌中，挑取典型的菌落，使用马丁汤培养，用常规方法进行生化试验，结果见表1。

5.血清型鉴定结果。对铜川市某养殖场送检的60份病料，经鉴别分离出40株肉鸡源大肠杆菌菌株，分离率为66.67 %。其中40株肉鸡源大肠杆菌中有33株鉴定出O血清型，占分离菌株的82.50 %；7株未定型，占分离菌株的17.50%。鉴定出的33株大肠杆菌O血清型分别为O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株），其中主要的血清型为O78、O2、O8三种，占分离菌株总数的72.73 %，结果见表2。

6.药敏试验结果。结果显示，环丙沙星对大肠杆菌的敏感性较高；卡那霉素、红霉素对大肠杆菌的敏感性一般；青霉素、链霉素、庆大霉素对大肠杆菌的敏感性较低；说明环丙沙星作为治疗该病首选药物。具体结果见表3。

三、讨论

本研究通过对铜川市的40株肉鸡源致病性大肠杆菌分离菌株的血清型鉴定结果可以知道O78、O2、O8等菌株出现的频率很高，这与国内外研究报道的O78和O35禽致病性大肠杆菌常见血清型基本相符。

本研究分离鉴定出40株肉鸡源大肠杆菌菌株，分离率为66.67%，分离率较高，表明大肠杆菌病在该地区发生频繁，是养殖业中常见病之一。通过分析我们可以知道，该病的发生与多种因素有关，如饲养管理不当、营养失衡、疫苗接种所产生的应激、天气恶劣或继发于其他的疾病等。该病多以混合感染的形式出现，大肠杆菌病产生的概率也越来越高，治疗也越来越困难，目前大肠杆菌病已居于细菌性疾病之首。现在，如果只是单一防治大肠杆菌病已经难以收到理想的效果，与此同时应该消除其他可能性的致病因素。在已经出现耐药性的鸡场尤其是高发地区，最好能进行大肠杆菌的药敏试验，筛选出高敏药物，制订出合理的给药计划，配合环境消毒，改善饲养管理的条件，从而达到理想的治疗效果。

目前养殖业发展速度非常快，细菌的耐药性问题也越来越受到人们的关注。林居纯等2009年对来自我国不同地区的588株大肠杆菌进行耐药性检测，结果显示禽源大肠杆菌的多重耐药性现象非常严重，禽源菌株占95.12%。

◎图3 分离菌在显微镜下的形态（×100）

随着大肠杆菌耐药菌株不断增加，肉鸡大肠杆菌病的有效防治也越来越难，严重危害畜牧业健康发展。细菌的耐药性是可以通过质粒的接合、转导、转化在细菌间转移扩散，威胁人类的身体健康。因此，我们需要寻找有效、能够延缓和减少细菌耐药性产生的治疗方法。首先，我们应该学会科学适当的养殖、防止过度滥用药物；条件好的养殖场应该通过药敏试验来选择用药；优化饲养管理的方式，减少大肠杆菌病的发生。