宫颈癌组织中miRNA-125a、STAT3、IL-10的表达变化及意义

李秀福，贾世峰，耿彤瑶，王新月，张琪，马冬，李鸥

(1华北理工大学研究生学院，河北唐山063000；2华北理工大学附属医院；3唐山工人医院)

宫颈癌是导致全世界妇女癌症相关死亡的第4大原因[1]。目前研究表明，高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是其发生、发展的必要因素[2,3]。然而，宫颈局部免疫平衡状态的改变在HR-HPV感染转归中具有重要作用。而白细胞介素10(IL-10)作为一种具有免疫抑制作用的细胞因子对宫颈癌变的发生、发展具有重要作用，当其在人体内大量合成可抑制免疫系统的调控，引起HPV病毒入侵，导致宫颈癌的发生。IL-10作为TH2型细胞因子，其表达调控主要发生在转录水平[4]。尽管最新研究表明，miR-125a靶向调控信号转导及转录活化因子3(STAT3)在宫颈癌细胞中发挥抑制增殖、侵袭与转移作用[5]，但是在免疫平衡调节中作用的研究未见报道。本文进行了相关探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年9月～2017年3月唐山工人医院住院部就诊的宫颈鳞癌患者(接受根治性子宫切除及盆腔淋巴结切除术)的术中切除病理标本56例份(宫颈癌组)，纳入标准：临床资料完整；病理明确诊断为宫颈鳞癌；术前未接受过放、化疗。排除标准：术前3个月内曾行宫颈治疗，如阴道用药、激光治疗等；患者为妊娠状态；合并其他妇科恶性肿瘤，如子宫内膜癌、卵巢癌等；合并其他脏器肿瘤，如肠道、乳腺肿瘤等。其中患者年龄40～69(55.27±6.18)岁，病程1～3(2.12±0.28)年；按宫颈癌国际妇产科联盟(FIGO)(2000年)临床分期标准进行临床分期[6]：Ⅰ期34例，Ⅱ期22例；组织分化程度：高、中分化37例，低分化19例；有淋巴转移11例，无淋巴结转移45例；肿瘤直径>40 mm者15例，≤40 mm者41例。另选同期行全子宫切除术的子宫良性病变患者术中切除病理标本40例份作为对照组，患者年龄40～65(52.76±5.32)岁，病程1～4(2.78±0.62)年。两组年龄有可比性。对照组纳入标准：因子宫良性病变而行全子宫切除术者，如子宫肌瘤、子宫腺肌症等；宫颈薄层液基细胞学检查未见非典型鳞状细胞或癌细胞。排除标准同宫颈癌组。取组织标本前均未行放、化疗或免疫治疗。标本收集后于-80 ℃冰箱保存。所有患者知情同意，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 宫颈组织中miR-125a、STAT3、IL-10 mRNA表达的检测 参照文献[7,8]方法采用RT-qPCR法检测miR-125a mRNA，qRT-PCR法检测STAT3 mRNA和IL-10 mRNA。将液氮保存的宫颈组织按TRIzol试剂盒说明书提取组织总RNA，以RNA为模板，采用反转录试剂盒(Invitrogen)进行反转录。反转录条件：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，75 ℃、15 min。miR-125a的茎环结构；5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACA-3′；反转录结束后进行PCR扩增。PCR反应体系按试剂盒说明配制。具体引物序列：miR-125a-F：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTTTAA-3′;miR-125a-R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′;STAT3-F:5′-AAGAGGCGGCAACAGATT-3′;STAT3-R:5′-CGGTCTTGATGCCGAGGG-3′;IL-10-F: 5′-ACAAAG-GAAGGAGGGGTTCAC-3′;IL-10-R:5′-AGAAGTGGA-CTCAGCATGGG-3′;U6-F:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′;U6-R:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGT-GAC-3′;GAPDH-F:5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTA-A-3′;GAPDH-R: 5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3′。 miR-125a、STAT3和IL-10 mRNA三者PCR扩增的反应条件为：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，72 ℃、35 s共40个循环，记录循环阈值(Ct)，采用2-ΔΔCt法计算miR-125a、STAT3和IL-10 mRNA的相对表达量。每组实验重复3次，比较两种标本miR-125a mRNA、STAT3 mRNA、IL-10 mRNA相对表达量。miR-125a mRNA以U6为内参基因，STAT3 mRNA、IL-10 mRNA以GAPDH为内参基因。

1.3 宫颈组织中STAT3和IL-10蛋白表达的检测 采用免疫组织化学Elivision二步法。按照试剂盒操作说明书进行操作。一抗抗体分别采用鼠抗人STAT3(Proteinch，1∶100比例稀释)、鼠抗人IL-10(Proteinch，1∶80比例稀释)，二抗采用通用型HRP标记兔抗鼠抗体，DAB显色。阴性对照组中，以PBS液代替一抗。染色结果判定：STAT蛋白以细胞质内出现明显的黄色或棕黄色颗粒为阳性着色，少数位于细胞核；IL-10染色为棕黄色或褐色颗粒，多数位于细胞质。参照Mattern等[9]的方法进行判定。阳性染色深度：未见染色为0分，轻度染色(浅黄色)为1分，中度染色(棕黄色)为2分，深度染色(棕褐色)为3分；阳性细胞百分比：未见染色为0分，染色细胞小于25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。两方面得分相加，0～2分判为阴性表达，>2分判为阳性表达，随机选择10个高倍视野(×50倍)，计数1 000个细胞，取均值。

2 结果

2.1 宫颈组织中miR-125a、STAT3和IL-10 mRNA的表达 宫颈癌组、对照组中miR-125a mRNA相对表达量分别为4.20±0.79、11.02±3.20，与对照组比较，宫颈癌组miR-125a mRNA相对表达量降低(P<0.05)；宫颈癌组、对照组中STAT3 mRNA相对表达量分别为5.21±1.70、1.00±0.34；IL-10 mRNA相对表达量分别为5.82±1.34、0.81±0.56；与对照组相比，宫颈癌组STAT3和IL-10 mRNA的相对表达量均升高(P均<0.05)。

2.2 宫颈组织中STAT3和IL-10蛋白的表达 STAT3蛋白阳性信号呈棕黄色或棕褐色颗粒状，弥漫或局灶性分布于肿瘤细胞质及核周，而肿瘤间质组织未见STAT3蛋白阳性染色。IL-10染色为棕黄色或褐色颗粒，多数位于细胞质，少数位于细胞核。与对照组相比，宫颈癌组STAT3表达强，宫颈癌组中STAT3阳性表达率高[69.7%(39/56)比22.5%(9/40)](χ2=20.74，P<0.01)；与对照组相比，宫颈癌组IL-10阳性表达率高[(58.9%(33/56)比7.5%(3/40)](χ2=27.12，P<0.01)。

2.3 宫颈癌组织miR-125a及STAT3 mRNA的相对表达量与患者临床病理特征的关系 宫颈癌组miR-125a mRNA的表达水平与宫颈癌的组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与年龄、肿瘤大小无关(P均>0.05)；宫颈癌组STAT3 mRNA的相对表达量与组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与年龄、肿瘤大小、FIGO分期无关(P均>0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组织miR-125a和STAT3 mRNA表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

2.4 宫颈癌组织中miR-125a mRNA与STAT3、IL-10 mRNA表达的相关性 Pearson相关分析结果显示，宫颈癌组中，STAT3 mRNA和miR-125a mRNA的相对表达量呈负相关(r=-0.285 4，P=0.024 5)；IL-10和STAT3的mRNA相对表达量呈正相关(r=0.457 8，P=0.000 4)。

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见恶性肿瘤[10]。迄今为止，每年有529 800个新增病例，死亡病例275 100个，且多发生于发展中国家[11]。临床治疗手段包括手术、放疗及化疗，后两种治疗手段会对机体免疫系统产生持久而显著的影响。目前，宫颈癌的免疫治疗逐渐成为研究的热点。前期研究表明，宫颈局部免疫状态的改变在宫颈癌发生发展中具有重要作用[12]。IL-10是一种具有免疫抑制作用的因子，通过多种途径抑制机体免疫系统对肿瘤的杀伤作用，造成HR-HPV的持续感染进而促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭与转移[13]。IL-10基因的表达主要是通过启动子区一系列转录因子的结合进行调控，例如STAT3[14]，STAT3是STATS家族重要成员之一，在对照组织中多数呈低表达水平，而在多种恶性肿瘤中往往呈持续性高表达。研究表明，STAT3的高表达能够促进肿瘤的发生发展，如肝癌[15]、胃癌[16]。本研究结果显示，与对照组相比，STAT3 mRNA和蛋白在宫颈癌组中均呈高表达，且随着宫颈癌分化程度降低及淋巴结转移，STAT3的表达进一步提高。相关性分析结果显示，STAT3和IL-10的mRNA表达水平呈正相关，且免疫组织化学染色结果显示，宫颈癌组STAT3及IL-10的蛋白表达水平均高于对照组，提示STAT3可能通过调控IL-10的表达，从而使宫颈局部免疫状态失衡，造成HR-HPV持续感染，促进宫颈癌的发生与发展，但两者具体调控机制尚未明确。

通过在线预测软件TARGETSCAN发现，STAT3与miR-125a存在结合位点。众所周知，miRNAs需通过相应的靶向基因才能发挥多种生物学过程，包括肿瘤的发生与发展。miR-125a位于染色体19q13上，在不同病理类型肿瘤中具有促癌和抑癌作用[17]，在不同肿瘤中表达程度亦不相同，有可能成为治疗恶性肿瘤的新靶点或肿瘤标记物[18]。Zheng等[19]发现，miR-125a在肝癌中低表达，可作为其发展进程的标志物，在肝癌病程进展中起到监测作用。本研究结果显示，与对照组相比，宫颈癌组miR-125a的相对表达量下降，与文献[5]报道一致，且随着肿瘤向晚期进展、分化程度降低及淋巴结转移，miR-125a的相对表达量进一步降低，与患者的年龄及肿瘤大小无明显相关性。进一步研究显示，在宫颈癌组中，STAT3和miR-125a的表达水平呈负相关，提示miR-125a与STAT3可能存在靶向调节关系，宫颈癌中miR-125a、STAT3和IL-10之间相互作用，形成免疫逃逸，促进宫颈癌的进展，但三者具体调控机制尚不清楚。

综上所述，随着宫颈癌恶性程度的进展，miR-125a表达水平降低，可使STAT3的表达上调，并进一步提高IL-10的表达水平，造成免疫逃逸，使HR-HPV持续感染，促进宫颈癌的发生与发展，本研究为治疗宫颈癌提供了新靶点。

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