仔猪肠源枯草芽孢杆菌体外耐受性研究

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(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

0 引言

腹泻是影响仔猪培育生长的重要因素之一，它严重影响和制约着仔猪的存活率及养殖者的经济效益[1]。市售治疗仔猪腹泻的药物很多，但多存在药物残留、毒副作用等问题，绿色健康的益生菌制剂已成为研究热点。我国农业部第1126号公告中允许使用的饲料微生物添加剂有16种。其中益生菌—枯草芽孢杆菌以能够有效促进动物生长、提高增重、防治动物下痢等作用被广泛研究应用[2]。本试验研究了健康仔猪肠道分离的枯草芽孢杆菌体外耐受性，为进一步研制相关益生菌制剂提供参考。

1 材料与方法

(1)菌株 枯草芽孢杆菌SY-B3 由齐齐哈尔市某猪场仔猪肠道分离获得。

(2)主要试剂 LB固体培养基(干粉)、LB肉汤培养基、胰蛋白酶(索莱宝科技有限公司)、猪胆盐(购于北京奥博星生物技术有限公司)。

(3)主要仪器及设备 电热恒温培养箱、高压灭菌器、超净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司生产)、恒温振荡器(型号为HZQ-FX)，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生产。

(4)制备菌液 用无菌接种环挑取少量分离保存的枯草芽孢杆菌与LB平板上，划线，37℃温箱培养24h，挑取单一菌落，接种到LB肉汤培养基中，37℃培养至细菌生长的对数期，平板计数，菌液浓度为2×108cfu﹒mL-1，待用。

(5)存活率计算 存活率计算公式[3]如下

(6)耐酸性试验 配制LB肉汤培养基，分为4组，用稀盐酸调节pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0按2%的量接种菌液，37℃，180 r·min-1摇床内培养，分别于1 h、2 h和3 h取样0.1 mL进行平板计数，并计算枯草芽孢杆菌的存活率。

(7)耐胆盐试验 取LB肉汤培养基，分别配制含猪胆盐0.1%、0.3%、0.5%及2%的量接种菌液，37℃，180 r·min-1摇床内培养，于2 h、4 h和8 h取样0.1 mL进行平板计数，并计算枯草芽孢杆菌的存活率。

(8)耐高温试验 将10mL菌液分别至于在70℃、90℃、100℃下水浴，并在3 min、10 min、20 min时间点取样0.1mL进行平板计数，计算枯草芽孢杆菌的存活率。

2 结果

2.1 耐酸性试验结果

枯草芽孢杆菌的耐酸性试验结果如图1所示，不同pH的培养基中，随着培养时间的延长，枯草芽孢杆菌存活率下降，并且随着pH值的降低存活率下降明显；在酸度最高pH 2.0的培养基中培养1h的存活率为89.4%，培养3h存活率仍然达到64.7%。

图1 耐酸性试验结果

2.2 耐胆盐试验结果

枯草芽孢杆菌的耐胆盐试验结果如图2所示，在添加了不同浓度胆盐的培养基中，其存活率随浓度增大及培养时间的延长明显下降，0.3%胆盐浓度中存活率培养8h后仍在60%以上，但在0.5%胆盐浓度中培养8h后下降到29.9%。

2.3 耐高温试验结果

如图3所示，随着温度的提高或者孵育时间的延长枯草芽孢杆菌的存活率下降明显，在70℃条件下孵育有较好的存活率，达到70%以上，但在100℃条件下孵育3min存活率就下降到2.5%，20min后仅为0.2%。

图2 耐胆盐试验结果

图3 耐高温试验结果

3 讨论

仔猪消化道环境非常复杂，断奶后仔猪的消化道环境比成年健康猪的变化更多。如胃内pH值，哺乳仔猪pH 4.0左右，断奶后5d内pH升至5.5～6.0，之后逐渐下降，60日龄后逐步接近成年猪水平(pH=3.0)[4]；消化道中分泌的胆汁能够抵御外生物对动物的侵害，消化道中胆汁浓度在0.03%～0.3%[3]；本试验参考周明等[5-8]方法考察分离仔猪肠源枯草芽孢杆菌的耐酸和耐胆盐能力，结果表明其具有较强的耐酸性和耐胆盐能力。

在益生菌制成制剂的过程中很多都需要经过高温(70℃～100℃)处理的过程，所以耐热性也是考察益生菌的重要指标。本试验设计枯草芽孢杆菌的耐高温试验，在70℃处理20min后仍有较高的存活率，在100℃高温下存活率较低，结果表明仔猪肠源枯草芽孢杆菌对高温有一定耐受性。

通过本试验发现，分离的仔猪肠源枯草芽孢杆菌有较强的的抵御仔猪消化道复杂环境的能力，同时也为进一步研究相关制剂提供参考。

参考文献

[1]邱进杰，熊焰，杨智.健康仔猪肠道内抗逆性乳酸菌的选育[J].中国兽医杂志，2008,44(4):86-87.

[2] 钟蔚.枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺研究[D].南京：南京农业大学，2013.

[3] 刘明珠.乳酸粪肠球菌耐受性、抑菌作用及其对瘤胃发酵功能影响研究[D].南昌：江西农业大学，2013.

[4] 刘宇.猪用乳酸杆菌、双歧杆菌、纳豆芽孢杆菌复合活菌制剂的研制[D].大庆：黑龙江八一农垦大学，2008.

[5] 周明，王欢，李泽阳. 猪肠源性枯草芽孢杆菌耐逆性研究[J]. 安徽农业大学学报,2013, 40(4): 519-522.

[6] Yuyong He, Chunxia Mao, Hong Wen,et al. Influence of ad Libitum Feeding of Piglets With Bacillus Subtilis Fermented Liquid Feed on Gut Flora, Luminal Contents and Health[J]. Scientific Reports , 2017(7):44553.

[7] 周珍文，胡旭初，邓秋连,等.枯草杆菌芽孢抵抗为肠道环境的耐性评估[J].热带医学杂志，2008,8(3)：235-237.

[8] 陈琳，彭虹旎,孔垂斌,等.几株饲用益生菌对体外模拟胃肠道环境的抗逆性评估[J]. 中国微生态学杂志，2010,22(8)：701-704.