高脂血症奶牛乳腺组织中脂代谢相关生化指标和基因表达的变化

明鹏飞 黄莹莹 邹苏萍 董妍丽 聂星灿 冯士彬 王希春 程建波 李锦春 吴金节 李 玉

(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)

奶牛乳腺是奶牛特有的器官，其血液供应极为丰富，乳腺上皮细胞从血液中吸收乳前体物质并将其转化为乳糖、脂肪和蛋白质，乳腺上皮细胞是一个重要的“生物工厂”，只有深入了解奶牛乳腺的代谢模式，才能对乳腺主要营养物质的合成和分泌进行合理的调控[1]。脂肪酸是奶牛乳腺营养物质中重要的组成部分，乳脂中超过95%的脂肪酸以甘油三酯(TG)的形式存在，其余以磷脂、胆固醇酯、甘油二酯、甘油一酯和游离脂肪酸形式存在[2]。在奶牛生产中，由于妊娠和泌乳的需要，容易造成泌乳初期机体的能量负平衡(NEB)，NEB直接导致低血糖，使奶牛体内胰高血糖素含量显著升高，促进脂肪的分解，导致非酯化脂肪酸(NEFA)浓度的增加和活性氧(ROS)水平升高。当大量的NEFA进入肝脏时，超过了肝脏的氧化能力，多余的NEFA经不完全氧化产生酮体[β-羟丁酸(BHBA)、乙酰乙酸(ACAC)及丙酮]，引发奶牛酮病和脂肪肝，进一步促进营养代谢紊乱性疾病的发生[3-5]。众多研究已经证明，脂肪肝和酮病等营养代谢紊乱性疾病的发生与奶牛能量代谢紊乱有关，能量代谢紊乱导致机体免疫功能和炎症应答能力下降，对疾病的易感性增强[6-9]。高脂血症是指体内血浆脂质代谢异常，主要指血浆总胆固醇(TC)、TG和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量升高以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量降低[10]。近年来，高脂血症及相关疾病的发病率不断升高，深入探讨高脂血症发病的分子生物学机制，为临床高脂血症的治疗提供试验依据显得尤为重要[11-12]。因此，本试验利用全自动生化分析仪检测血清生化指标和乳腺脂代谢指标，苏木精-伊红(HE)染色和油红O染色后观察乳腺组织病理形态学变化，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测乳腺脂组织中脂代谢相关基因的表达，揭示奶牛高脂血症发生机理，为临床高脂血症引起的奶牛乳品质下降提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养

奶牛由安徽省某奶牛场提供，根据血液脂代谢检测结果，从中筛选6头正常和6头高脂血症荷斯坦奶牛，所选奶牛年龄、胎次相近，预产期相近，生理状态相近。采用全混合日粮(TMR)饲喂奶牛，根据奶牛的营养需求配制试验饲粮，其组成及营养水平见表1。

1.2 血液和组织样本的采集

于清晨空腹时选取12头奶牛，尾静脉采集5 mL非抗凝血，4 ℃静置30 min，3 500 r/min离心10 min，收集血清，分装于2 mL离心管，-20 ℃冷冻保存，待测血清生化指标。血清生化指标的检测结果如表2，将6头血清TG和TC含量高于正常范围的奶牛作为高脂组试验动物，将另外6头血清TG和TC含量在正常范围内的奶牛作为正常组试验动物。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)每千克预混料含有Contained the following per kg of the premix：VA 200 000 IU，VD 70 000 IU，VE 1 000 IU，Fe 2 000 mg，Cu 600 mg，Zn 2 400 mg，Mn 1 300 mg，I 6 mg，Se 17 mg，Co 7 mg。

2)泌乳净能为计算值，其他为测定值。NELwas a calculated value, while the others were measured values.

采血结束后将12头奶牛颈静脉放血致死，沿腹中线切开，剖开乳腺，切取部分乳腺组织，生理盐水冲洗后迅速置于10%中性甲醛溶液中固定，以便后续做HE染色和油红O染色。其余部分迅速置于液氮中冷冻，之后保存于-80 ℃冰箱待测乳腺组织中脂代谢相关基因的相对表达量。

表2 血清中生化指标检测结果

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表4和表5同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4 and Table 5.

1.3 乳腺组织中脂代谢相关生化指标检测

取乳腺组织100 mg液氮研磨，在研磨后的粉状乳腺组织加入庚烷-异丙醇-吐温20抽提液(3.00∶2.00∶0.01)5.01 mL，1 800×g、4 ℃离心10 min，收集上清液[13]，采用全自动生化分析仪检测乳腺组织中TC、TG、HDL-C、LDL-C和VLDL的含量。

1.4 乳腺组织HE染色观察

将固定的乳腺组织取出，流水冲洗24 h，依次进行70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精脱水，时间均为1 h，二甲苯透明、浸蜡包埋、切片(切片厚度为5 μm)、展片、烤片后，用二甲苯脱蜡，然后用100%、95%、80%、70%梯度酒精复水，时间均为5 min，苏木精染色、70%盐酸酒精分色、伊红复染后，70%(1～3 min)、80%(1～3 min)、95%(3 min)、100%(5 min)梯度酒精脱水，二甲苯透明、中性树脂胶封片，最后显微镜下观察乳腺组织结构病理变化。

1.5 乳腺组织油红O染色观察

饱和油红O原液按3∶2(油红O∶蒸馏水)加入蒸馏水，混匀，室温放置5～10 min，滤纸过滤后备用。将置于-80 ℃超低温冰箱中保存的乳腺组织样品取出，放入-20 ℃冰箱中缓冲30 min后，再置于含有OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋剂的冷冻组织切片机上进行切片，调整切片厚度为5～8 μm[14]，自然晾干后用甲醛-钙固定10 min、蒸馏水充分洗涤、60%异丙醇浸洗、油红O染液染色10 min、60%异丙醇分化至间质清晰、蒸馏水清洗、Mayer苏木素复染、蒸馏水再次清洗、甘油明胶封片，之后显微镜下观查乳腺组织结构病理变化。

1.6 乳腺组织中脂代谢相关基因qRT-PCR检测

取冻存乳腺组织100 mg，加入液氮研磨成粉末后，利用Trizol Reagent快速提取试剂盒提取乳腺组织总RNA。利用Invitrogen反转录试剂盒进行反转录。将反转录产物保存于-20 ℃保存备用。根据GenBank中奶牛乳腺脂代谢相关基因序列，采用Primer 5.0软件设计引物，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，利用qRT-PCR法检测脂代谢相关基因的相对表达量，结果以2-ΔΔCt表示。具体引物序列见表3。

1.7 数据统计与处理

试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行Student’st检验，Duncan氏法进行组间多重比较，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，所有试验数据均采用平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺组织中脂代谢相关生化指标检测结果

如表4所示，与正常组相比，高脂组奶牛乳腺组织中TC、TG和VLDL的含量显著升高(P<0.05)，HDL-C的含量呈降低趋势，LDL-C的含量呈升高趋势，但差异均不显著(P>0.05)。

表3 qRT-PCR引物序列

表4 奶牛乳腺组织中脂代谢相关生化指标检测结果

2.2 奶牛乳腺组织HE染色镜检结果

如图1所示，HE染色可见，正常组(图1-A、图1-B)乳腺腺泡结构完整，乳腺细胞排列整齐，细胞界限清晰，未见病理学变化；高脂组(图1-C、图1-D)细胞核被染成蓝色，细胞间质被染成紫红色，腺泡上皮细胞脱落，乳腺腺泡壁明显增厚，有充血情况，细胞肿胀，部分细胞脂滴增多，部分细胞核染色质浓缩、边移、细胞轮廓不清。

正常组：A，10×；B，40×。高脂组：C，10×；D，40×。下图同。

Normal group: A, 10×; B, 40×. High lipid group: C, 10×; D, 40×. The same as below.

图1奶牛乳腺组织HE染色图片

Fig.1 HE staining pictures for mammary tissue of dairy cows

2.3 奶牛乳腺组织油红O染色观察结果

如图2所示，正常组(图2-A、图2-B)可见细胞核明显呈蓝色，红色区域较少，主要集中在细胞边缘，仅有少量脂滴聚集；高脂组(图2-C、图2-D)有大片红色区域，红色加深，小叶间结缔组织密度增加，乳腺上皮可见脂滴相互融合形成大的空泡状脂肪细胞，细胞边界模糊，细胞核染色质浓缩、边移。

2.4 奶牛乳腺组织脂代谢相关基因qRT-PCR检测结果

如表5所示，与正常组相比，高脂组奶牛乳腺脂代谢过程中的内源合成关键酶基因乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)以及活化相关基因乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)、长链脂酰辅酶A合成酶1(ACSL1)的相对表达量显著升高(P<0.05)，摄取和转运关键基因脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、分化抗原簇36(CD36)、脂蛋白脂肪酶(LPL)，去饱和酶关键基因硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸去饱和酶1(FADS1)以及乳酯化关键基因乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)的相对表达量显著降低(P<0.05)，合成调控关键酶基因固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)以及乳酯化关键基因甘油-3-磷酸脂酰转移酶(GPAM)、磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、二酰甘油脂酰转移酶1(DGAT1)的相对表达量呈降低趋势，但差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

高脂血症是指血液中脂类含量升高的一种代谢性疾病，临床上常以血脂水平升高及血液外观异常为特征，表现为血清TC、TG含量升高、HDL含量降低，继发肥胖、高血压、糖尿病等[15-16]。本试验以高脂血症奶牛为研究对象，结合血清相关生化指标的检测、病理形态学的观察和乳腺脂代谢相关基因的表达，比较全面地探讨了高脂血症奶牛血清中主要生化指标的变化和乳腺脂代谢相关基因表达的变化。本试验中，高脂血症奶牛血清胰岛素(INS)、HDL-C的含量呈降低趋势，血清TC、LDL-C的含量呈升高趋势，李天宇[17]奶牛高酮血症的部分血液生化指标特征研究中证实高脂血症奶牛血液中TC、TG含量升高，这与本试验的检测结果是一致的。血液指标被认为是监测奶牛群体健康和预测奶牛群体患病风险的主要依据[18]，本试验根据奶牛血清生化指标中INS含量差异和脂代谢指标中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量差异将奶牛分为正常组和高脂组。HE染色病理学观察可见，正常组奶牛乳腺组织中乳腺腺泡细胞的结构完整，乳腺细胞排列整齐，细胞界限清晰，未见病理学变化，而高脂组奶牛乳腺组织细胞核被染成蓝色，细胞间质被染成紫红色，乳腺腺泡上皮细胞脱落，乳腺腺泡壁明显增厚，有充血情况，细胞肿胀，部分细胞脂滴增多，部分细胞核染色质浓缩、边移，细胞轮廓不清。这与唐海林等[19]利用改良的脂肪染色法观察到的含有大量脂肪组织的器官HE染色的结果相一致。油红O染色法主要是将脂肪细胞中的脂肪(主要指TG)特异性地染成红色，一般来说，脂肪含量越高，油红O染色时着色就越多，红色区域就越大[20-22]。本试验中，油红O染色可见正常组奶牛乳腺组织细胞核明显呈蓝色，红色区域较少，主要集中在细胞边缘，仅有少量脂滴聚集，而高脂组乳腺组织有大片红色区域，且红色加深，小叶间结缔组织密度增加，乳腺上皮可见脂滴相互融合形成大的空泡状脂肪细胞，细胞边界模糊，细胞核染色质浓缩、边移。这与甄贞等[23]的研究结果一致。qRT-PCR检测结果显示，高脂组奶牛乳腺组织中脂代谢摄取和转运关键基因FABP3、CD36，去饱和酶关键基因SCD、FADS1，乳酯化关键基因AGPAT6的相对表达量显著降低，活化相关基因ACSS2、ACSL1的相对表达量显著升高，与张娜等[24]在奶牛乳腺调控乳脂合成关键基因表达分析的试验中得出的CD36、AGPAT6、DGAT1相对表达量降低的结果相一致。本试验结果在一定程度上提供了关于高脂血症奶牛乳腺组织脂代谢相关基因表达变化的信息。但由于基因表达的变化受到多种复杂因素的影响，所以目前仍不能明确解释这些信息变化之间的相互关系以及各基因表达改变的临床意义，这些问题尚需在后续的研究中进一步验证和探讨。

图2 奶牛乳腺组织油红O染色图片

新生畜能量和必需脂肪酸主要来源于乳脂，哺乳期乳腺是合成TG的主要器官。乳脂合成主要包括3个阶段，即脂肪酸的合成、TG的合成和脂滴的形成。TG主要贮存于脂肪组织中，在血液中以水溶性脂蛋白形式存在。TG含量的测定主要用于判断脂代谢状况，TG含量降低表明肝脏合成和分泌VLDL的能力降低。胆固醇在血液中常与载脂蛋白结合，以可溶性脂蛋白的形式存在，胆固醇含量测定对脂代谢异常和某些肝胆疾病的诊断具有一定意义。当胆固醇相关代谢途径基因的表达量下降时，机体的代谢处理功能负荷不了胆固醇的产生，可造成胆固醇的分解代谢异常，导致胆固醇堆积，造成血脂水平异常。目前，整个乳脂代谢合成过程的分子机制尚未完全明确。乳脂的合成由多个转录因子及其功能基因协作完成，研究表明，固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、PPARγ是调控乳脂合成的重要因子，它们通过结合下游乳脂合成相关基因的核酸序列来启动这些基因的表达。因此，研究乳脂合成相关基因的表达变化和调控机理可以完善泌乳机制[25-27]。

表5 奶牛乳腺组织中脂代谢相关基因qRT-PCR检测结果

本试验仅选取了奶牛乳腺组织中脂代谢相关的若干个基因作为研究对象，在后续的试验中还可以将更多参与脂代谢的相关基因纳入研究范围，结合免疫组织化学法和蛋白质免疫印迹反应的检测以及其他分子生物学技术，从而更全面地研究高脂血症奶牛脂代谢模式。

4 结 论

高酯血症奶牛乳腺组织出现大量脂滴蓄积，乳腺上皮细胞形成空泡变性，细胞核染色质浓缩、边移的典型病理变化；同时，高脂血症促使奶牛乳腺组织中脂代谢指标发生紊乱，相关脂代谢基因表达发生变化，其作用机制可能与高脂血症促进乳腺脂肪酸合成有关。

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