茧蜂病毒感染Hi5细胞与亲环素A的相关性研究

胡 艳, 许翠仙, 张 潘, 俞 丹, 张斌月, 李 明

云南大学生命科学学院, 云南省高校动物遗传多样性和进化重点实验室, 昆明 650091

自然界中存在着广泛的寄生与被寄生的关系。农业生产中的害虫——斜纹夜蛾，可被双斑侧沟茧蜂寄生，双斑侧沟茧蜂在其排卵时可特异性的寻找宿主(斜纹夜蛾幼虫)，并将其携带的茧蜂病毒和卵一同注入宿主体内[1]，利用病毒破坏宿主的免疫系统，以保护其卵和幼虫在宿主体内正常发育[2]。

截至目前，共获得17个类似于环状DNA分子的双斑侧沟茧蜂病毒基因组，经进一步分析，得到116个功能性基因，其中，28个是锚蛋白(Ankyrin)家族基因，28个是蛋白酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)家族基因[3]。通过比对本课题组得到的转录组及病毒基因组的测序数据，可确认在被寄生的斜纹夜蛾的血淋巴转录组中有13个病毒基因，主要为可编码PTP、病毒锚蛋白重复序列结构(viral ankyrin repeat，vank)的基因[4]。本研究选取其中的4个病毒基因(PTP109、vank86、vank92和vank101)作为病毒感染的检测指标，而基因vank86同时还作为病毒感染细胞后的表达检测指标。

亲环素A(cyclophilin A，CypA)是一种具有顺反异构酶活性的功能性蛋白，属于亲环素蛋白家族的一种，是免疫抑制剂环孢霉素A(cyclosporin A，CsA)的主要靶分子[5,6]。亲环素A可催化脯氨酸残基N端肽键的顺反式异构化[7]，从而加速蛋白质的折叠和重组。目前，对哺乳动物中CypA的生物学活性已有一定的研究。其作为自分泌和旁分泌因子，可以介导细胞通讯[8～10]，并且在细胞凋亡、免疫调节、T细胞活化以及蛋白质的折叠、转运、重组等方面具有重要作用[11,12]。研究表明，亲环蛋白(cyclophilin，CyP)可协助外源病毒感染机体，如CypA可与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)中基因所编码的衣壳蛋白结合，促使病毒感染人体，通过其顺反异构酶活性，促进HIV衣壳蛋白复合物的分解[13～15]。

本课题组前期研究发现，当双斑侧沟茧蜂寄生于斜纹夜蛾幼虫后，斜纹夜蛾幼虫血细胞中亲环素A的基因转录水平和蛋白表达水平都有上调(未发表数据)，但茧蜂病毒感染昆虫细胞的生物学机制尚不清楚；同时，成功构建到pIZT/V5-His-CypA质粒，其能在昆虫细胞中稳定表达，并可用于细胞内CypA功能的研究[16]。在本研究中，分别利用cypa沉默序列FAM CypA-SiRNA-22[16]、CsA处理Hi5细胞，以达到沉默cypa基因的表达、抑制CypA活性的目的，并利用pIZT/V5-His-CypA转染Hi5细胞以过表达cypa基因，从而，探讨CypA对茧蜂病毒侵染昆虫细胞的影响，确定两者之间是否存在一定的相关性，以期为进一步了解茧蜂病毒感染昆虫细胞的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1实验材料 实验中所用昆虫为斜纹夜蛾，斜纹夜蛾卵片及其饲料配制方法均由中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室提供，实验室饲养环境为27℃，相对湿度为60%～80%；双斑侧沟茧蜂(Microplitisbicoloratus)通过中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室获得，实验室饲养环境为27℃，相对湿度为60%～80%；Hi5细胞系为粉纹夜蛾(TrichoplusianiHübner)卵细胞系，由中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室细胞培养室提供。

1.1.2实验试剂 PrimescriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser(RR047A)、逆转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)、SYBR©Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)(RR820A)、RNA提取试剂盒(RNAisoTMPlus)均购于大连宝生物有限公司；无内毒素小量质粒提取试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ(D6950-01B)来自美国Omega Bio-Tek公司；X-tremegene HP DNA Transfection Reagent(06366236001)来自瑞士Roche公司；PDVF膜购于美国Millipore公司；Tubulin抗体、蛋白Marker以及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联的山羊抗鼠、抗兔二抗均购于上海碧云天生物技术有限公司；环孢霉素A购于美国Cayman Chemical公司；1×磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、脱脂奶粉均购于昆明培根生物科技有限公司；氯仿、乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)、30%丙烯酰胺混合液、1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH 8.8)、1.0 mol/L Tris(pH 6.8)、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵、微量注射器、0.45 μm滤膜、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于昆明鼎国生物科技有限公司；昆虫培养基Hyclone TNM-FH(AWA93766)、胎牛血清、超敏化学发光试剂盒均购于美国赛默飞世尔科技公司；NEST细胞培养板购于无锡耐思生物科技有限公司；CypA的特异性抗体由云南滇工科技有限公司制备；FAM CypA-siRNA-22由苏州吉玛基因股份有限公司合成。

1.1.3引物设计与合成 实验所用引物均通过Primer 5设计完成后(引物序列见表1),交至昆明硕擎生物科技有限公司合成，用于病毒基因克隆和qRT-PCR。其中，基因vank86、vank92、vank101、PTP109的引物均由云南大学生命科学学院刘樾彤设计和惠赠。

表1 实验所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in the experiment.

1.2 细胞培养

从-80℃冰箱中取出Hi5细胞冻存管，迅速放入37℃水浴融化；在超净工作台中将存有Hi5细胞的冻存液(含二甲基亚砜(DMSO)100 μL、胎牛血清400 μL、完全培养基500 μL)转入已灭菌的1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清；再加入1 mL完全培养基(含10%胎牛血清)稀释，并转入25 mL密封型细胞培养瓶中，置于28℃恒温培养箱中培养，第2天移去完全培养基，再加入新鲜的完全培养基继续培养，随后每3天更换1次。

1.3 病毒感染细胞

取20只羽化后3～4 d的双斑侧沟茧蜂雌蜂，借助解剖镜取出其卵巢，放于500 μL的1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4)中。在超净工作台中，通过用注射器反复抽吸，将卵巢破碎，12 000 r/min、4℃离心3 min后，收集上清液。再使用0.45 μm滤膜过滤上清液中的卵及其他细胞碎片，收集滤液于已灭菌的1.5 mL EP管中，置于-20℃保存，并在后续实验中用于感染细胞。

在六孔板上每孔铺2×105个Hi5细胞，贴壁培养40 min；根据初始细胞量加入适量的病毒粒子，一般按照1只成熟雌蜂(即1 Wasp)卵巢的病毒粒子可以感染1×105个Hi5细胞的剂量加入[17,18]。以未感染病毒的Hi5细胞作为对照组。

1.4 病毒基因的PCR鉴定

①RNA提取：在六孔板上每孔铺2×105个细胞。当六孔板中细胞的生长密度达到80%～90%时，用1×磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻洗涤贴壁细胞2次，按照RNAisoTMPlus试剂盒说明书提取总RNA。

②PCR鉴定：按照逆转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)说明书操作，合成PCR所需的模板cDNA。PCR反应体系(15 μL)：ExTaq7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1.0 μL，灭菌水5.5 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，58℃(由引物Tm决定)30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。

1.5 沉默、过表达cypa以及抑制CypA活性对病毒基因表达的影响

1.5.1RNA干扰(RNA interference，RNAi)实验 在六孔板上每孔铺2×105个细胞，贴壁培养30 min，弃培养基，加入新鲜的完全培养基。取8 μL罗氏转染试剂加至100 μL双无培养基中，混匀后室温静置30 min；取8 μL FAM CypA-SiRNA-22，用100 μL双无培养基稀释，混匀；再将上述2种试剂混匀，室温静置20 min，用于细胞转染。随后，将转染混合物逐滴加入六孔板相应的细胞中，置于28℃恒温培养箱中培养24 h。

1.5.2CsA处理细胞 在六孔板上每孔铺2×105个细胞，贴壁培养40 min；向每孔细胞中逐滴加入1 mmoL CsA(终浓度为1 μmoL)，置于28℃恒温培养箱中培养24 h。

1.5.3pIZT/V5-His-CypA转染细胞 取50 μL pIZT/V5-His-CypA甘油菌[16]加入LB培养基中，于37℃恒温空气摇床中过夜培养。然后，8 000 r/min离心5 min，收集菌体。在超净工作台中按照试剂盒Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ(D6920-01B)说明书操作，提取转染使用的无内毒素质粒pIZT/V5-His-CypA。转染方法同1.5.1。

1.6 实时荧光定量PCR

①胞内总RNA的提取方法同1.4①；②按照逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)说明书操作，合成进行qRT-PCR所需的模板cDNA；③以②中的cDNA为模板，按照试剂盒SYBR© Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)配制qRT-PCR反应体系(10 μL)：2×SYBR Premix ExTaq5 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，灭菌水3 μL。将样品分装到96孔板中，每个样品重复3次，置于Biosystems 7500 Real-Time PCR System中反应。采用两步法进行PCR扩增：第一步，95℃ 30 s；第二步，95℃ 5 s；60℃ 34 s，共40个循环;④反应结束后，将每个样品3次重复的Ct值求出平均值，以18S rRNA作为内参，计算RQ=2-ΔΔCt值，其中涉及到的其他参数计算如下：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)；ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)，3次重复。

1.7 Western blot检测

将六孔板中的细胞培养基倒掉，用PBS清洗2次，再用细胞刮刀刮下，置于已灭菌的1.5 mL EP管中，3 000 r/min离心5 min。加80～100 μL的细胞裂解液，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。并配制SDS-PAGE胶(分离胶10%，积层胶5%)，进行蛋白电泳(80 V，40 min；100 V，90 min)后，经湿转膜仪转至PDVF膜(100 V，100 min)，用PBST缓冲液(含吐温-20的PBS)冲洗，再放入5%脱脂牛奶中，于室温条件下封闭1 h。随后，用PBST溶液清洗2次，每次10 min，再分别采用CypA抗体、Tubulin抗体进行孵育，4℃过夜。然后，用PBST缓冲液清洗3次，每次10 min，再分别用HRP山羊抗兔IgG、HRP山羊抗鼠IgG抗体孵育，37℃ 1 h。最后，用PBST缓冲液清洗3次，第1次10 min，第2次5 min，第3次5 min。发光前将PierceTMECL Western blotting Substrate A、B液等体积混匀滴在PVDF膜上，与膜接触1 min，随后置于Tanon-4100中曝光成像。

1.8 统计学分析

所有的数据结果均采用GraphPad Prism 6统计学分析软件进行统计分析，结果以平均值±标准差表示。采用t检验进行2个样本间均数差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 茧蜂病毒感染Hi5细胞

在Hi5细胞培养基中加入茧蜂病毒50 μL(25 μL=1 Wasp)24 h后，以逆转录合成的cDNA为模板，利用PCR扩增鉴定茧蜂病毒基因vank86、vank92、vank101和PTP109的表达情况。结果显示，在未感染细胞中，均未检测到4个病毒基因，而在感染了24 h的Hi5细胞中，均扩增到4个病毒基因(图1)，表明茧蜂病毒成功侵染了Hi5细胞，并进行了扩增。

同时，经qRT-PCR检测，结果显示，茧蜂病毒侵染Hi5细胞后，cypa基因的转录水平显著上升(图2A)，而Western blot分析结果也表明CypA的蛋白表达水平有所提高(图2B)。

2.2 沉默cypa基因与抑制CypA活性对病毒基因vank86表达的影响

FAM CypA-SiRNA-22转染Hi5细胞24 h后，提取RNA并逆转录为cDNA，经qRT-PCR检测，结果(图3A)显示cypa基因的转录水平显著下降，而Western blot分析结果(图3B)表明，CypA蛋白表达水平也有所下降，但不明显(其中SiRNA-Control[16]为阴性对照)。这证明FAM CypA-SiRNA-22可以起到沉默cypa的作用。在此基础上，加入茧蜂病毒感染细胞24 h，提取RNA逆转录为cDNA，经qRT-PCR检测，结果发现，细胞中的病毒基因vank86基因转录水平极显著下降(图3C)。

图2 茧蜂病毒感染的Hi5细胞中CypA的表达情况Fig.2 The expression of CypA in MbBV-treated Hi5 cells.A：qRT-PCR检测cypa基因转录水平；B.Western blot检测CypA蛋白表达水平。注：Mock：未感染病毒组；MbBV：感染病毒组；**表示处理组数据与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

而在病毒侵染的细胞培养基中加入CsA以抑制CypA活性，24 h后，经qRT-PCR检测，vank86基因转录水平也显著下降(图3D)。

2.3 过表达cypa对病毒基因vank86表达的影响

pIZT/V5-His-CypA转染Hi5细胞24 h后，qRT-PCR与Western blot的分析结果(图4A、B)均表明，pIZT/V5-His-CypA可起到过表达cypa的作用(其中pIZT/V5-His为阴性对照)。在此基础上，加入茧蜂病毒感染细胞24 h后，提取RNA并逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR检测，结果发现，茧蜂病毒中的vank86基因转录水平极显著上升(图4D)。

3 讨论

双斑侧沟茧蜂病毒与普通病毒类似，都是由核衣壳包裹核酸，再由单层或者多层蛋白囊膜包裹1个或者多个核衣壳[18]。每个茧蜂病毒粒子所含的病毒量并不一样，病毒只存在于寄生蜂雌蜂输卵管萼上皮细胞中。在寄生过程中，病毒粒子伴随着1粒或者多粒卵以及萼液一同被注入寄主血腔中，进入血腔的病毒感染血细胞后，通过各种病毒基因的表达来抑制和破坏寄主的免疫反应[19～21]。目前，茧蜂病毒侵染血细胞的分子机理尚不清楚，但有报道显示CypA参与了多种病毒的感染和复制[14,22]。

图3 cypa沉默与抑制后相关基因的表达情况Fig.3 The expression of related genes when cypa was silenced and CypA was suppressed.A：qRT-PCR检测cypa基因转录水平；B：Western blot检测CypA蛋白表达水平；C：qRT-PCR检测cypa沉默后vank86基因转录水平；D：qRT-PCR检测CypA活性被抑制后vank86基因转录水平。注：Mock：未感染病毒组；MbBV：感染病毒组。*和**分别表示处理组数据与对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

图4 过表达cypa后相关基因的表达情况Fig.4 The expression of related genes when cypa was overexpressed in Hi5 cells.A：qRT-PCR检测cypa基因转录水平；B：Western blot检测CypA蛋白表达水平；C：qRT-PCR检测感染细胞中过表达cypa后cypa基因转录水平；D：qRT-PCR检测感染细胞中过表达cypa后vank86基因转录水平。注：Mock：未感染病毒组；MbBV：感染病毒组。*和**分别表示处理组数据与对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

本研究为了探讨茧蜂病毒在侵染昆虫组织的过程中，CypA是否协助或参与了这一过程，采用1株粉纹夜蛾Hi5细胞作为研究对象，首先利用茧蜂病毒感染该细胞，经PCR扩增鉴定，结果(图1)显示在病毒感染的Hi5细胞中检测到了4个作为检测指标的病毒基因(PTP109、vank86、vank92和vank101)；而在未感染细胞中并未检测到这4个病毒基因，表明该细胞可以被双斑侧沟茧蜂病毒感染，而且进行了转录。vank86基因属于双斑侧沟茧蜂病毒中编码锚蛋白结构域的成员之一，这一类基因在病毒基因组中所占比例较高，与果蝇中的IκB基因高度同源，研究显示vank86可能与核转录因子NF-κB的抑制有关，从而参与了茧蜂病毒对寄主免疫系统的抑制[3]。由于茧蜂病毒基因数量众多，很难做到对每一个茧蜂病毒基因感染昆虫细胞的过程进行检测。因此，为了确定茧蜂病毒在感染Hi5细胞时是否与CypA有关，本研究选取茧蜂病毒基因中的典型基因vank86，作为后续实验中茧蜂病毒的检测指标。研究发现，在茧蜂病毒感染的细胞中，在cypa被沉默或CypA活性被CsA抑制时，vank86基因转录水平显著下降(图3C、D)；而在过表达cypa时，vank86基因转录水平则明显升高(图4)。这些现象表明茧蜂病毒在感染Hi5细胞的过程中，以vank86为代表的茧蜂病毒基因的转录水平，会随着CypA活性及其基因转录水平、蛋白表达水平的变化而产生同样的变化趋势，两者之间可能存在一定的正相关。

目前，大量的研究主要集中于茧蜂病毒是如何抑制寄主的免疫反应和发育的[23,24]，而其侵染机制的研究尚未见报道。本研究首次试图去探讨茧蜂病毒侵染昆虫细胞的机制，但由于尚未获得各种茧蜂病毒蛋白的相关特异性抗体，因此在研究过程中主要检测了当宿主细胞内CypA发生变化时茧蜂病毒基因vank86的转录水平，但其翻译水平的变化尚不可知。由此可见，本研究的研究结果存在一定的局限性。此外，还需进一步研究茧蜂病毒中其他基因的变化情况，特别是CypA是否与茧蜂病毒中的一些蛋白存在相互作用，从而帮助茧蜂病毒的侵染。

总而言之，通过本研究发现CypA可能参与了茧蜂病毒侵染昆虫细胞的过程，但其如何协助或参与茧蜂病毒的侵染过程及具体分子机理等还需进一步探究。而阐明茧蜂病毒侵染昆虫的分子机理，一方面可以完善寄生蜂对宿主的寄生机制，另一方面为寻找和开发新的生物防治资源提供一定的依据。

参 考 文 献

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