红三叶AFLP体系的建立及优化

蒲小剑，田久胜，田新会，杜文华(.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070； .甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070)

扩增片段长度多态性(AFLP)是由RFLP与RAPD结合而成的一种新的分子标记技术，具有RFLP标记和RAPD标记的优点，有“最有力的分子标记”或“下一代分子标记”的称号[7]。因其高多态性，可靠，高效[8]，DNA用量少，检测率高[9]，重复性高，加上选择为中性[10]等许多优点，AFLP技术普遍应用于生物研究领域。近年来，AFLP技术在牧草种质鉴定方面的应用发展迅速，在紫花苜蓿(Medicagosativa)[11]，燕麦(Avenasativa)[12]，狗牙根(Cynodondactylon)[13]，老芒麦(Elymussibiricus)[14-15]，扁蓿豆(Medicagosativa)[16]，鸭茅(Dactylisglomerata)[17]等牧草的鉴定中均有报道。孟丽娟[18]通过对来自美国、加拿大和俄罗斯的31份红三叶材料运用ISSR分子标记建立并优化了适宜红三叶ISSR分析的最佳反应体系，扩增出58条多态性条带，后通过UPGMA聚类分析将试验材料分为5类。Mamta Gupta等[19]使用36对简单序列重复(SSR)引物分析全球收集红三叶材料的遗传多样性，其扩增片段1～6个，多态性值0.301～0.719，贝叶斯聚类模型分析将研究材料分为3类。Herrmann等[20]利用优化AFLP体系探索了野生和栽培红三叶群体的遗传特性和亲缘关系。Muntean等[21]用AFLP分子标记对红三叶品种遗传多样性进行了评价。虽然AFLP技术的原理简便，但步骤繁多，从酶切反应到银染成像的优化，若一个步骤或条件不合适，就出现带型不稳定、条带不清晰和多态性偏低等问题。所以，以岷山红三叶和红三叶新品系为试验材料，筛选AFLP优化条件，旨在建立适宜红三叶的AFLP反应体系，为红三叶分子遗传研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

田间试验在甘肃省临洮县临洮农校农场进行，地理位置E 103°87′，N 35°37′，海拔1 892 m，降水量562 mm，无霜期80～190 d，年平均气温7.0℃(最高气温34.6℃，最低气温-29.5℃)。土壤为黑麻土，肥力均匀，有灌溉条件，前茬作物为玉米。

1.2 试验材料

试验材料为以岷山红三叶为父本(Male parent，M)、抗白粉病红三叶新品系(甘农PR1)为母本(Female parent，F)杂交形成的F1代群体，以及2亲本。2015年3月下旬将杂交F1代种子点播，株距20 cm，行距30 cm，播种深度1(2 cm，得到F1代群体。于生长期间采摘幼嫩叶片1～2 g，放入液氮保存，带回实验室-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3 试验试剂与仪器

MseI，EcoRI和T4DNA连接酶购自Thermo Scientific，2×PCR Master Mix与DNA Marker购于BBI Life Sciences。引物及接头(表1)上海生工生物工程有限公司人工合成，其他试剂均为国产分析纯。

试验所用仪器见表2。

表1 接头和引物序列Table 1 Sequence of the adapter and primer

表2 试验仪器Table 2 Experimental instrument

1.4 基因组DNA制备及检测

采用改进CTAB法[22-23]提取红三叶基因组DNA。1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，TE稀释后用超微量紫外分光光度计检测D260nm/D280nm，D260nm/D230nm，以确定DNA的纯度与浓度。

1.5 体系优化筛选条件

体系优化筛选条件：酶切时间，DNA浓度，EcoRI、MseI浓度见表3；预扩增体系见表4，选择性扩增体系进行优化设计见表5。

表3 优化体系筛选条件设计及筛选结果Table 3 Optimization system screening conditions design and screening results

表4 预扩增正交体系设计Table 4 Orthogonal design for pre-amplification

表5 选择性扩增引物组合编号Table 5 Primer numbers

注：E代表EcoRI，M代表MseI。

1.6 AFLP反应体系

1.6.1 基因组DNA双酶切 选取2种限制性内切酶EcoRI/MseI，反应体系共20 μL。包含，10×Tang buffer 3 μL，模板DNA(200～300 ng/μL)9 μL，8 UEcoRI，6 UMseI，ddH2O补平。双酶切时间，37℃水浴5 h、65℃水溶15 min。-20℃保存酶切产物。

1.6.2 接头连接 合成的单链人工接头稀释至50 μmol/L，经PCR反应合成双链，加入3 U T4DNA连接酶，于22℃下连接过夜。

1.6.3 AFLP预扩增反应 反应总体系30 μL，包括4 μL连接产物模板DNA，0.8 μLEcoRI，0.6 μLMseI预扩增引物，15 μL 2×PCR Master Mix，ddH2O补平，离心混匀进行PCR反应。

1.6.4 AFLP选择性扩增反应 反应总体系20 μL，包括2 μL稀释10、20、25、30、40、50倍的预扩增产物(稀释30倍)；0.8 μL Primer E，1.0 μL Peimer M，2×PCR Master Mix6、7、8、9、10和11 μL；ddH2O补平后进行PCR反应。

1.6.5 扩增产物检测 制备4%变性聚丙烯酰胺凝胶，待胶聚合后预电泳30 min。选择扩增产物(2 μL)与上样Buffer混匀，经90℃变性3 min，置于4℃保存等待点样。点样后1 500 V恒功率电泳1.5 h左右，停止电泳。采用Carlos银染方法[22-23]，胶版微干后拍照、统计数据。

2 结果与分析

2.1 DNA提取质量和检测

AFLP反应对DNA质量要求较高。高质量的DNA是获得重复性好、条带清晰AFLP扩增结果的关键因素。采取改良CTAB法提取红三叶基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示所提取的红三叶基因组DNA条带清晰、整齐、无拖尾(图1)。经超微量紫外分光光度计检测，D260nm/D280nm在1.7～1.9，D260nm/D230nm约为2，浓度在200 ng/μL。说明所提取DNA纯度高，浓度适中，能够达到下一步试验要求。

图1 红三叶基因组DNA电泳检测Fig.1 Agarose gel-electrophporesis of redclover genomic DNA注：1，2分别为红三叶DNA在1 %琼脂糖凝胶检测结果

2.2 酶切、连接体系优化

2.2.1 酶切时间优化 采用EcoRI和MseI进行基因组DNA酶切，识别序列分别为GAATTC和AATT。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。其DNA片段均在100～1 500 bp，表明酶切充分，符合试验要求(图2)。1～5条带亮度逐渐增加，6稍暗于5。因此酶切时间选用37℃ 5 h，65℃ 20 min。

图2 酶切时间优化电泳图Fig.2 Agarose gel-electrophporesis of gradientextracted enzyme digestion time注：1～6分别为3,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 h酶切连接琼脂糖电泳带型，M为D2000分子量标记

2.2.2 DNA浓度筛选 40～90 ng/μL电泳条带亮度逐渐变大，100 ng/μL条带亮度暗于90 ng/μL。90 ng/μL DNA进行酶切反应(图3)。

图3 DNA浓度筛选电泳图Fig.3 Agarose gel-electrophoresis of different DNA concentrations注：1～7的DNA浓度分别为40、50、60、70、80、90、100 ng/μL，M为D2000分子量标记

2.2.3EcoRI浓度筛选 电泳结果(图4)表明，1～4条带亮度随内切酶EcoRI浓度增加变大，而5、6条带亮度暗于4。EcoRI浓度筛选结果为8 U。

图4 EcoRI浓度筛选电泳图Fig.4 Agarose gel-electrophoresis of different EcoRI concentrations注：1～6的EcoRI浓度分别为2、4、6、8、10、12 U，M为D2000分子量标记

2.2.4MseI浓度筛选 电泳结果(图5)表明1、3条带明显亮于其他条带，3的条带亮度最大。MseI浓度筛选结果为6 U。

2.3 预扩增体系的优化

根据表2设计的16个PCR扩增结果图。整体效果不理想，仅第4与第6有条带。第6条带的亮度明显优于第4条带。因此，预扩增体系为，连接产物，4 μL(稀释10倍)；Primer E0，0.8 μL；Peimer M0，0.6 μL；2×PCR Master Mix，15 μL；ddH2O，9.6 μL(图6)。

图5 MseI(Trμ9I)浓度筛选电泳图Fig.5 Agarose gel-electrophporesis of different MseI (Trμ9I) concentration注：1～6的MseI(Trμ9I)浓度分别为2、4、6、8、10、12 U，M为D2000分子量标记

图6 预扩增正交设计电泳图Fig.6 Agarose gel-electrophporesis on orthogonal design of pre-amplification注：1～16代表正交体系编号，同表4

2.4 选择性扩增体系优化

2.4.1 预扩增产物稀释倍数筛选 在众多因素中，预扩增产物稀释的倍数对选择性扩增效果的影响最大。为使条带清晰、稳定，预扩增产物被稀释不同倍作比对试验，结果显示，最适宜的扩增效果是稀释30倍(图7)。

2.4.2 2×PCR Master Mix用量筛选 2×PCR Master Mix是即用型的常规PCR预混合溶液，含有TaqDNA Polymerase，dNTP混合物，MgCl2以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增(图8)，其用量大小会直接影响PCR结果。琼脂糖凝胶电泳表明，10 μL PCR产物电泳条带最亮，7 μL PCR产物次之，6 μL PCR产物最暗。

选择性扩增体系：预扩增产物，2 μL(稀释30倍)；Primer E，0.8 μL；Primer M，1.0 μL；2×PCR Master Mix，10 μL；ddH2O，6.2 μL。

图7 预扩增产物稀释倍数处理下选择性扩增Fig.7 Effects of pre-amplification product diluted multiples on selective amplification注：1～6分别为5、10、15、20、25、30、40倍Mix用量，M为D2000分子量标记

图8 2×PCR Master Mix用量处理下选择性扩增Fig.8 Effects of concentration of 2×PCRMasterMix on selective amplification注：1～6分别为6、7、8、9、10、11 μL 2×PCR Master稀释，M为D2000分子量标记

2.4.3 引物对的筛选 从8条EcoRI酶切位点接头选择性引物和8条MseI酶切位点接头选择性引物组合共计64对选择性引物中筛选。只有1对引物组合没有扩增出条带，2对引物扩增结果与其他引物组合扩增条带重复，其余引物组合均能获得较清晰条带。其中31对引物的扩增图谱(图9)。选取16对条带清晰且条带数较多的引物组合进行后续分析。

3 讨论

AFLP被认为是十分理想、高效的分子标记技术，己经被广泛应用到水稻等作物的遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位和连锁图谱构建等方面[24]。AFLP试验分析中，DNA模板限制性内切酶酶切是否充分、酶切片段T4DNA连接酶的连接是否成功是影响AFLP试验成功与否的关键，限制性内切酶及 T4DNA连接酶的用量根据模板 DNA量而定[25]。AFLP可采取单酶切、双酶切，据报道TE-AFLP用3种酶进行酶切反应[26]。双酶切具有DNA片段长度较小，易于分离扩增产物等优点，因此得以大量应用于试验研究。高品质基因组DNA的提取，是AFLP反应体系成功建立的关键[27]，若含有质量较差的DNA时，试验结果的稳定性将会受到很大影响[28-29]。试验用于酶切的DNA经检测D260 nm/D280 nm的比值在1.7～1.9，纯度较高。琼脂糖凝胶电泳检测显示，不含RNA和其他杂质，完全达到了AFLP技术的要求。双酶切反应中，限制性内切酶对DNA的酶切必须完全彻底，否则扩增后变性聚丙烯电泳会出现多而密、中下部扩增带稀少的现象，EcoRI较MseI敏感，更容易受DNA质量和体系中各成分的影响，因此在酶切反应中，采用EcoRI酶切缓冲液作为双酶切的缓冲液。

图9 引物筛选电泳图Fig.9 Agarose gel-electrophporesis of primer screening注：M为DNA Marker(BBI Life Sciences)

AFLP反应中，不同材料的酶切时间、预扩增产物的稀释倍数和选择性扩增引物浓度这3个关键反应条件有所不同[30-31]。蔡丽艳等[11]构建苜蓿cDNA-AFLP反应体系的酶切时间为37℃ 6 h，65℃ 20 min。刘欢等[12]构建燕麦AFLP体系酶切的时间为37℃ 4 h，65℃ 15 min。引物浓度是反应体系的重要组成部分，对试验结果影响比较大[32]。如果引物浓度偏低，PCR效率也会降低，扩增产物产量也相应减少；如果引物浓度偏高，可能会发生异位引导，导致非特异性意外扩增，影响试验结果的准确性[33]。试验为2种引物分别设置了6个引物浓度梯度，并筛选出了最优浓度。

AFLP操作时，由于胶板点样口限制，同一对引物所扩增出的所有样需分批进行点样、跑胶，这就造成了不同玻璃板之间显影的差别，人工统计条带时，人为因素造成的误差会降低AFLP技术的有效性。因此，为了提高试验的精确性，试验对引物初步筛选后，选出16对引物(点样板最多点样32个)对红三叶新品系和岷山红三叶进行多样性分析，筛选出11对清晰的扩增条带且多样性丰富的引物组合进行下一步实验。

4 结论

通过对决定AFLP体系的DNA浓度，酶切时间，两酶EcoRI和MseI浓度，预扩增产物稀释倍数，2×PCR Master Mix用量，引物组合等7个要素进行筛选，逐一筛选出对应上述要素的最优化量。分别为90 ng/μL，5 h，8 U，6 U，30倍，10 μL，构建了AFLP优化体系。按照筛选结果得到31条清晰条带。并选出11条进行后续分析。

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