12个苜蓿品种抗旱性综合评价

王 焱，蔡 伟，兰 剑，伏兵哲，高雪芹(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

苜蓿(Medicagosativa)是高产稳定、适口性好，营养价值丰富,适应性广的优良牧草，被誉为“牧草之王”[1-2]。其具有发达的根系系统，在地下10 m处也有根系分布，且可以利用土壤深层水，在西北干旱半干旱地区种植具有较强的抗旱能力[3]。宁夏全区苜蓿种植面积38.01万hm2，中南部旱作苜蓿种植面积15.39 hm2，占40.7%[4]，种植面积较大。近年来随着气候变暖，水资源短缺，加之宁夏中南部干旱区干旱少雨，且该地区种植的苜蓿品种陈旧混乱、抗旱性差、产量低，这些因素严重制约了当地苜蓿产业的发展。因此，筛选抗旱性强的优良苜蓿品种，不仅可以解决当地水土流失、土壤风蚀等环境问题，而且可以提高旱作苜蓿的种植水平和产量。

干旱胁迫不仅会影响苜蓿的生长，对后期苜蓿的越冬、产量也有一定的影响。研究苜蓿的抗旱性，对抵抗自然条件对苜蓿发展的制约及提高苜蓿生存发展具有重要意义[5]。目前，对苜蓿抗旱性的研究比较多，刘卓等[6]研究报道，试验测定的指标反映的牧草品种抗旱能力各不相同，这与不同品种适应干旱环境的方式不同有关。张曦等[7]研究表明，叶面积、比叶重对水分胁迫的反应较为敏感。干旱胁迫越严重，对叶厚的影响越大。翟春梅等[8]研究表明，SOD，POD和CAT的酶活性对保护紫花苜蓿抵御干旱胁迫有一定的范围。这些研究都为苜蓿抗旱性评价奠定了良好的基础。以12个苜蓿品种为对象，采用PEG-6000胁迫的方法，对苜蓿苗期的抗旱性进行综合评价，以筛选抗旱苜蓿品种，为宁夏中南部地区旱作苜蓿种植提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验苜蓿来源及秋眠级见表1。

1.2 试验设计

试验设计分两部分：萌发期抗旱和苗期抗旱。

1.2.1 萌发期抗旱试验设计 选取均匀一致的12个苜蓿品种种子各50粒，经HgCl2消毒，用清水冲洗干净、晾干，置于有双层滤纸的9 cm培养皿中，分别加入不同水势的聚乙二醇(PEG-6000)溶液。采用PEG-6000模拟干旱法，分别配制12.5%、17.6%、21.1%、23.9%溶液(其对应的溶液水势分别为-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa)，试验对照组(CK)以蒸馏水代替PEG-6000溶液，对照和处理均设3个重复。置于人工智能气候培养箱中，20℃恒温，光照强度5 000 lx，湿度50%，光照周期12 h/12 h(光照/黑暗)[10]。每日补充对应浓度的PEG-6000溶液，每3 d更换滤纸，以保持培养皿内渗透势恒定。发芽以胚根露白为标准，每隔24 h观察记录发芽种子的数量。萌发结束后(连续3 d未有新增发芽种子)测定幼苗和幼根长度，发芽期为7 d。

表1 试验苜蓿品种、来源及休眠级Table 1 The source and the fall dormancy grade of alfalfa cultivars

1.2.2 苗期抗旱试验设计 在20℃室温下，采用Hoagland营养液配方水培12个品种苜蓿幼苗100株。水培装置包括营养液盆、水培筐、沙网、碎石、细砂[11]。播种前设备和材料均在90℃高温下灭菌5 h，苜蓿种子经HgCl2消毒。当幼苗长至三叶期时进行干旱胁迫。试验设置5个水势0(CK)、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2 MPa。处理后每2 d进行称量补水以维持溶液浓度。处理后第7 d取样，时间8∶00～10∶00。

PEG-6000溶液不同水势梯度的计算：

ΨS=-(1.18×10-2)×C-(1.18×10-4)×C2+(2.67×10-4)×C×T+(8.39×10-7)×C2×T

式中：ΨS为溶液的水势(bar)；C为PEG-6000溶液的浓度(g/kg H2O)；T为温度(℃)。

依据公式1bar=0.1 MPa，用试算法计算试验设计水势的PEG-6000溶液浓度。因营养液的浓度很低，可认为其密度与水一致。温度取均值20℃。计算结果为1 kg水里溶解143.2 g，PEG-6000水势为-0.3 MPa；溶解213.6 g，PEG-6000水势为-0.6 MPa；溶解268.0 g，PEG-6000水势为-0.9 MPa；溶解313.9 g，PEG-6000水势为-1.2 MPa[12-13]。

1.3 指标测定

萌发期指标测定：相对发芽率=处理种子发芽数/对照种子发芽数×100%(萌发第7 d的发芽数)；相对发芽势=处理种子发芽势/对照种子发芽势×100%(萌发第5 d的发芽数)；萌发指数(GI)：GI=∑GT/DT(GT为第T天的发芽数；DT为相应的天数)。

苗期指标测定：叶绿素(chl)含量采用乙醇浸提法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法；脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法测定[14-15]。

各指标数值均为相对值。某指标相对值=(处理组/对照组)×100%。

1.4 综合评价方法

用模糊数学隶属函数进行耐旱性综合评价：

X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X(u)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：X(u)为隶属函数值；X为某一PEG胁迫处理下某指标的相对值；Xmax 为此指标中的最大值；Xmin为此指标的最小值。若某一指标与耐旱性呈正相关，用公式(1)，若呈负相关，用公式(2)计算[16-19]。

1.5 数据处理

用DPS v8.01版软件进行方差分析，聚类分析及回归分析。用Microsoft Excel 200制图表和隶属函数分析。

2 结果与分析

2.1 种子相对发芽率分析

12个苜蓿品种的相对发芽率随不同水势的PEG溶液胁迫下的差异均不显著，说明12个苜蓿品种的种子在PEG溶液干旱胁迫下均逐渐减少，在-0.3 MPa时，德国德贝最大，为85.97%，在-1.2 MPa，新疆大叶苜蓿最大，为9.39%(表2)。

通过表3回归分析表明，PEG溶液水势每降低0.1MPa，苜蓿品种从丰宝至德国德贝的相对发芽率分别下降8.5%、8.3%、7.8%、7.4%、7.3%、8.4%、8.4%、8.0%、7.7%、7.7%、8.4%、8.4%。苜蓿相对发芽率与胁迫溶液的水势之间有极显著的正相关关系，平均相关值0.983。

表2 苜蓿品种在不同水势的PEG胁迫溶液下种子的相对发芽率Table 2 Relative germination percentage of 12 alfalfa cultivars seeds under PEG stress in fifferent water %

表3 苜蓿品种种子相对发芽率与不同PEG胁迫溶液水势之间的相关回归关系Table 3 The correlation between the relative germination rate of different alfalfa seeds and the water potential of different PEG stress solutions

2.2 种子相对发芽势分析

在PEG模拟干旱胁迫下，苜蓿种子相对发芽势随干旱胁迫程度的增加整体呈下降趋势，在-0.3 MPa下，有10个品种的相对发芽势大于对照，在-0.6 MPa下，除丰宝和新疆大叶苜蓿的相对发芽势超过对照外，其余10个品种的相对发芽势呈下降趋势，平均相对发芽势为63%；在-0.6 MPa之后，不同品种的苜蓿种子相对发芽势随干旱胁迫程度的增加迅速下降，降幅为86.8%，在-0.9 MPa下有丰宝、苜蓿王1号、德国德贝3个品种的相对发芽势为0，在-1.2 MPa下9个品种的平均相对发芽势为0。

根据不同品种苜蓿在不同PEG溶液水势下的种子平均相对发芽势，对12个苜蓿品种的耐旱性进行排序，丰宝>德国德贝>新疆大叶苜蓿>爱菲尼特>宁苜1号>皇后 2000>苜蓿王1号>WL324>大富豪>阿尔冈金>四季旺>West blend。其排序结果与平均相对发芽率的排序结果差距很大，说明苜蓿种子萌发初期和萌发后期的发芽率在干旱胁迫下的差别很大，所以在评价苜蓿耐旱性时，利用相对发芽率和相对发芽势两个指标共同评价是必须的。

表4 苜蓿品种在不同水势PEG胁迫溶液下种子的相对发芽势Table 4 Relative germination potential of 12 alfalfa cultivars seeds under PEG stress in different water potential %

注：*在0.05水平上显著；** 在0.01水平上显著，r(0.05,0.01)=0.878,0.959

2.3 萌发指数(GI)分析

12个苜蓿品种的萌发指数随PEG溶液水势的降低，整体呈下降趋势(表5)。从CK到-0.3 MPa，12个苜蓿品种的萌发指数平均降幅为37.7%，从-0.3MPa到-0.6 MPa，12个苜蓿品种的萌发指数平均降幅为51.3%，从-0.6～1.2 MPa，12个苜蓿品种的萌发指数迅速下降，平均降幅为92.2%。

表5 苜蓿品种在不同水势PEG胁迫溶液下种子的萌发指数Table 5 Germination index of 12 alfalfa cultivars seeds under PEG stress in different water potential

注：*在0.05水平上显著；**在0.01水平上显著，NS为不显著；r (0.05,0.01)=0.878,0.959

在CK下，12个苜蓿品种间的萌发指数差异极其显著，在-0.6 MPa下，12个苜蓿品种间的萌发指数差异显著，在-0.3，-0.9和-1.2 MPa，12个苜蓿品种间的萌发指数差异不显著；从12个苜蓿品种的萌发指数与不同PEG溶液的水势之间的相关关系分析，除丰宝等4个品种的萌发指数与PEG溶液的水势呈显著的正相关关系外，其余8个品种的萌发指数与PEG溶液的水势呈极显著的正相关关系。

2.4 12个苜蓿品种萌发期抗旱性评价

以相对发芽率、相对发芽势、萌发指数3个指标对12个苜蓿品种进行聚类分析(图1)。

采用最短距离法可将12个苜蓿品种分为3类：抗旱性较强品种为四季旺、West blend；抗旱性适中品种丰宝；抗旱性较低品种WL324、大富豪、阿尔冈金、皇后2000、宁苜一号、苜蓿王1号、新疆大叶苜蓿、爱菲尼特、德国德贝。

图1 不同苜蓿品种耐旱性聚类分析Fig.1 Cluster analysis of drought resistance of different alfalfa varieties

2.5 干旱胁迫对苜蓿品种丙二醛含量的影响

水势从-0.3～-1.2 MPa，丙二醛相对含量均值分别为129.67%、179.67%、164.58%、150.83%，随水势的变化其值整体呈先上升后下降的趋势，且不同苜蓿品种间丙二醛相对含量差异显著(P<0.05)。在-0.6 MPa下，丙二醛相对含量为一个明显拐点(表6)。当低于-0.6 MPa时，数值开始下降，在-0.9 MPa下，丙二醛相对含量较-0.3 MPa降低了26.92%，

表6 干旱胁迫下丙二醛的相对含量Table 6 The variation of relative MDA content under drought stress %

注：数据为3次重复的相对平均值±标准误差；同列不同字母表示品种间差异显著(P<0.05)，下同

在-1.2 MPa时其值比-0.9 MPa降低了9.27%，说明此时细胞开始受到严重损伤。

2.6 干旱胁迫对苜蓿品种叶绿素含量的影响

结果表明，12个苜蓿品种的相对叶绿素含量在不同水势的PEG溶液胁迫下差异显著(P<0.05)。从-0.3～-1.2 MPa，叶绿素相对含量均值分别为149.41%、137.5%、177.33%、153.75%。在-0.9 MPa下达到最大值，此后，叶绿素相对含量开始下降，在-1.2 MPa时其值比-0.9 MPa时下降了14.93%(表7)。

在-0.9 MPa时，WL324品种较对照增加了207.52%，增长速度较快，而且绿叶素含量相对值最高，且与7个品种差异显著(P<0.05)(表7)。

2.7 干旱胁迫对苜蓿品种超氧化物歧化酶活性的影响

在PEG模拟干旱胁迫下，不同苜蓿品种超氧化物歧化酶活性随干旱胁迫程度的增加整体呈先上升后下降趋势，从-0.3到-1.2 MPa，超氧化物歧化酶活性均值分别为 85.5%、101.67%、95.08%、67.67%，且12个品种间超氧化物歧化酶活性差异显著(P<0.05)。在-0.3 MPa下，四季旺品种超氧化物歧化酶活性较对照上升了70.47%，上升速度最快，且与其他品种差异极显著(P<0.01)。在-0.6 MPa下，宁苜一号酶活性上升较明显，比在-0.3 MPa时上升了54.03%，说明其降低脂膜过氧化作用较强，抗旱性比较好。而在-1.2 MPa时，除WL324品种较对照上升了16.78%外，其余品种与对照相比，均下降明显。爱菲尼特在此水势下相对酶活性数值为39.44%，与其他品种相比数值最低，酶活性最弱(表8)。

表7 干旱胁迫下叶绿素的相对含量Table 7 The variation of relative chlorophyll content under drought stress %

表8 干旱胁迫下超氧化物歧化酶的相对活性Table 8 The difference of relative SOD content under drought stress %

2.8 干旱胁迫对12个苜蓿品种相对脯氨酸含量的影响

随PEG溶液水势的降低，12个苜蓿品种游离脯氨酸含量整体呈增长趋势，且不同品种间脯氨酸含量差异性显著(P<0.05)。在-0.3 MPa下，阿尔冈金品种脯氨酸相对含量明显高于其他品种，水势在-0.6 MPa时，苜蓿王1号、宁苜一号、德国德贝、阿尔冈金这4个品种脯氨酸含量均比-0.3 MPa时上升幅度快，分别上升了565%、782%、710%、868%。在-1.2 MPa下，丰宝、WL324、皇后2000、爱菲尼特4个品种的相对脯氨酸含量达到了最大值，分别为556%、593%、758%、1479%(表9)。

2.9 12个苜蓿品种苗期抗旱性的综合评价

12个苜蓿品种的抗旱性强弱顺序依次为：四季旺>宁苜一号>WL324>丰宝>苜蓿王1号>大富豪>West blend>阿尔冈金>德国德贝>皇后2000>新疆大叶苜蓿>爱菲尼特(表10)。

表10 隶属函数综合排序Table 10 Comprehensive ranking of subordinate function

3 讨论

植物抗旱性评价指标及方法有很多，根据其研究目的、测定的指标不同来选择适合的方法[20]，前人对此已做大量研究。试验选择了萌发期及苗期的不同指标进行抗旱性鉴定评价；并运用回归、隶属函数及聚类方法对苜蓿品种进行抗旱性分析。采用PEG-6000模拟干旱胁迫的方法，采用隶属函数、回归及聚类分析法综合评价了12个苜蓿品种的抗旱性，筛选出四季旺、丰宝等具有强抗旱性的苜蓿品种。

植物的抗旱性性状是由形态生理方面的综合变化来体现，不同植物对某一具体生理指标的抗旱性反应及抗旱性强弱表现均不一定相同，因而孤立的某个指标不能评价植物的抗旱性[22-25]。为了使评价更具准确性，采用萌发期及苗期不同的7个指标对苜蓿抗旱性进行综合评价，这些指标具有结果可靠、测定有代表性的特点，能客观的反映苜蓿在干旱胁迫中生理形态方面的变化。

试验目的及测定指标，萌发期采用方差、回归、聚类分析，苗期采用隶属函数方法进行综合评价。萌发期经回归及聚类分析筛选出四季旺、Westblend、丰宝等抗旱性较强的品种。苗期经隶属函数分析筛选出四季旺、宁苜一号、WL324、丰宝等抗旱性较强的品种。

4 结论

经分析12个苜蓿品种的相对发芽率、相对发芽势、萌发指数与PEG胁迫溶液的水势之间呈极显著正相关关系，因此，对苜蓿萌发期进行耐旱性评价时，种子相对发芽率、相对发芽势及萌发指数是很好的鉴定指标。经聚类可将12个苜蓿品种分为3类：抗旱性较强品种四季旺、West blend抗旱性适中品种丰宝；抗旱性较低品种WL324、大富豪、阿尔冈金、皇后2000、宁苜一号、苜蓿王1号、新疆大叶苜蓿、爱菲尼特、德国德贝。

随着干旱胁迫的增加，12个苜蓿品种的丙二醛、叶绿素含量及超氧化物歧化酶活性整体上均呈先上升后下降的趋势，脯氨酸含量整体呈现上升趋势。利用隶属函数分析，12个苜蓿品种的抗旱性综合评价能力强弱依次为：四季旺>宁苜一号>WL324>丰宝>苜蓿王1号>大富豪>West blend>阿尔冈金>德国德贝>皇后2000>新疆大叶苜蓿>爱菲尼特。因此，经萌发期及苗期综合分析，可筛选出四季旺、丰宝等抗旱性较强的苜蓿品种。

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