大建中汤治疗大鼠脾阳虚胃炎的机制*

武 静 杨莎莎 陈继婷 王俊霞 杨 毅 龚小雪 王 慧

(1 贵阳中医学院,贵阳 550002; 2 成都中医药大学博士研究生， 成都 610045)

慢性胃炎是指局限于胃黏膜层的慢性炎症,是消化系统中最常见的一类疾病,发病率高并常伴有癌变。它属于中医“胃脘痛”、“腹胀”、“嘈杂”、“痞证”等范畴。大建中汤作为治疗脾阳虚证的经典方剂,疗效确切,具有较高的开发应用价值。本课题组前期的研究表明,大建中汤在治疗脾阳虚腹痛中,血栓素-2、6-酮前列腺素、P-物质、COX-2等物质均改善[1-3],这些物质与炎症关系密切。本实验改良脾阳虚胃炎动物模型,RT-PCR、ELISA分别检测单核细胞的白介素受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-related kinase-4， IRAK-4) mRNA表达水平和血清白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)含量;并观察胃黏膜的病理变化,以探讨大建中汤治疗脾阳虚胃炎可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用健康清洁级SD大鼠60只,体质量200g±20g,雌雄各半,由重庆腾鑫生物技术有限公司提供,许可证号：〔SCXK(渝)2012—000J〕。饲养条件：清洁、通风,温度：15℃～25℃,湿度：55%～70%,混合饲料喂养。

1.2 分组和造模

实验大鼠随机分为6组,分为正常对照组,模型组,枸橼酸铋钾对照组,大建中汤高、中、低剂量组,每组10只。实验大鼠模型复制参考姒氏造模方法[4]略加改进,造模各组大鼠复制脾阳虚胃炎模型,主要分为2步。

1.2.1 脾阳虚造模 将大鼠正常饲养调整3d,使之适应环境后开始造模(除正常组外)。整个造模过程分为两大阶段(均自由饮水),共3周。第1阶段为前5d,饮食失节伤脾气——单日喂饲甘蓝10g/200g,双日喂饲精炼猪脂2mL/200g;劳倦过度伤脾气——每日38℃温水中游泳至疲劳(疲劳的标准为不能坚持游泳)。第2阶段为后6～21d,除饮食失节及劳倦过度因素外,加上苦寒泻下伤脾阳,每日加灌藩泻叶水浸液2ml/200g。大鼠出现倦怠、喜聚堆、腹泻、皮毛枯槁易落,不能坚持游泳、肛周污浊、躯体扭曲等现象,说明脾阳虚造模成功。

1.2.2 脾阳虚胃炎造模 脾阳虚造模成功后,给脾阳虚大鼠灌胃40%乙醇,每周一空腹1次,每次8ml/kg、20mmol/L去氧胆酸钠灌胃,每日上午1次,每次8ml/kg;0.05%～0.1%氨水作为大鼠日常饮用水自由饮用,并记录每日饮用量;0.05%吲哚美辛灌胃,每日下午1次,每次8ml/kg;并配以饥饱失常;连续90d后(每10d测体质量1次),脾阳虚胃炎动物模型复制成功,再将模型动物随机分为脾阳虚胃炎模型组、大建中汤大、中、小治疗组和枸橼酸铋钾对照组,每组10只。

1.3 试剂、药品、仪器

单核细胞分离试剂盒(加拿大Stem Cell公司);总RNA提取试剂盒,cDNA逆转录试剂盒(美国Fermentas公司);IRAK-4引物由大连宝生物设计合成;RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司);TNF-α放射免疫试剂盒(购于上海江莱生物科技有限公司);IL-6放射免疫试剂盒(购于上海研晶生化试剂有限公司);制作石蜡切片相关试剂,脱氧胆酸钠(上海日初生物科技有限公司);无水乙醇(分析纯),氨水(分析纯)。

大建中汤(贵阳中医学院中药制剂中心提供);100%番泻叶水浸液(自制);枸橼酸铋钾胶囊(丽珠集团丽珠制药厂生产,批号：261623);吲哚美辛肠溶片(重庆科瑞制药有限责任公司生产,批号：111025),可加水溶解后灌胃。

TGL16A台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);UV-1800紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司); HH-S4双列四孔恒温水浴锅(江苏省金坛市金南仪器制造有限公司);XSP-14A显微镜(上海光学仪器一厂);ProgRes®数码显微镜照相机(业纳上海仪器设备有限公司)等。

1.4 给药方法

从造模第91天开始分别给予各组大鼠相应药物灌服30d。具体为：正常对照组,灌服生理盐水7ml·kg-1·d-1;造模型组,灌服生理盐水7ml·kg-1·d-1;大建中汤高、中、低剂量治疗组,分别灌服大建中汤0.75、1.5、3.0g·kg-1·d-1;受试药对照组,灌服枸橼酸铋钾胶囊0.0162g·kg-1·d-1。

1.5 标本采集和保存

各组实验结束后,禁食24h,麻醉大鼠股动脉采血7ml,3000r/min离心15min(离心半径15cm),分离血清,-20℃保存。同时采集静脉血7ml,EDTA抗凝,按照Stem Cell公司的RosetteSep法提取外周血单核细胞(PBMC),-80℃保存。取大鼠胃小弯黏膜,-80℃ 保存。

1.6 病理组织学检测

取胃组织用石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(H-E)染色,光镜下组织形态观察。

1.7 放射免疫法测定血清

对IL-6、TNF-α的免疫活性进行测定,并绘制其标准曲线,采用放射免疫法测定其血清中IL-6、TNF-α含量,其操作过程严格按照试剂盒操作步骤说明进行。

1.8 对大鼠IRAK-4 mRNA表达的测定

单核细胞中IRAK-4 mRNA 表达水平测定,用TRIzol试剂抽提单核细胞总RNA,并逆转录为cDNA,采用SYBR GreenⅢ荧光定量检测IRAK-4 mRNA水平。以β-actin的PCR产物为内参标准,β-actin 基因上游引物5′-TGGGGTGATGCTGGTGCT GAGT-3′,下游引物为5′-AGGTTTCTCCAGGCGGC ATGTC-3′,扩增片段长度500bp;IRAK-4基因的上游引物为5′-TGCCTACTGCGTGTTGGGATTA-3′,下游引物为5′-CACACACACCCTCCAAACTCACT-3′,扩增片段长度为360bp;根据RT-PCR原始检测结果,分析得出各个样品的相对表达量。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 胃黏膜病理组织变化

光镜观察结果表明：正常对照组胃黏膜腺未见萎缩,黏膜上皮规则、整齐,固有层可见散在淋巴细胞;模型组大鼠胃黏膜腺萎缩,呈慢性炎症表现,固有层可见灶性浸润的淋巴细胞,有形成的淋巴滤泡,胃黏膜基层变厚;枸橼酸铋钾组可见胃炎大鼠黏膜腺体轻度萎缩,浆细胞、淋巴细胞呈散在的弥漫性浸润,有扩张的小血管伴纤维增生,黏膜下层轻度增厚;大建中汤高剂量组大鼠胃黏膜有浆细胞、淋巴细胞呈散在浸润;大建中汤中剂量组大鼠胃黏膜固有层可见淋巴细胞灶性浸润,偶见扩张的小血管;大建中汤低剂量组在鼠黏膜组织呈慢性炎症,黏膜固有层可见浆细胞、淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润,黏膜下层变厚(图1)。

图1 健脾温胃散对大鼠胃组织病理学的影响(H-E,×200)Fig 1 Effects of Dajanzhong decoction on stomach tissue pathology in rats (H-E,×200)A: Normal control group; B: Model group; C: Test drug control group;D: Dajianzhong high-dose group; E: Dajianzhong medium dose group; F: Dajianzhong small dose group

2.3 大鼠TNF-α、IL-6含量的变化

与正常对照组相比,模型组TNF-α、IL-6含量明显升高(P<0.01);与模型组相比大建中汤高、中剂量组TNF-α、IL-6含量明显降低(P<0.01);大建中汤高、中剂量组与受试药对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 各组大鼠TNF-α、IL-6含量变化Tab 1 Changes in TNF-α， IL-6 and IRAK-4 mRNA content in each group

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel

2.4 大鼠IRAK-4 mRNA表达的变化

与正常对照组比较,模型组中IRAK-4 mRNA表达明显升高,与模型组相比大建中汤高、中、低剂量组IRAK-4 mRNA表达明显降低(P<0.01),大建中汤高、中、低剂量组与枹橼酸铋钾对照组比较无差异(P>0.05)(表1,图2)。

3 讨论

中医经典方剂大建中汤以其在治疗脾阳虚胃肠疾病方面独特的疗效,被历代医家推崇。传统中医理论认为大建中汤具有温中补虚,降逆止痛、扶正祛邪的功效。而现代研究表明其具有抗炎、抗感染、抗肿瘤、驱寒镇痛的功效。大建中汤治疗胃炎有效机制可能与抑制幽门螺旋杆菌、保护胃黏膜、抗炎,影响胃黏膜内分泌细胞,胃肠激素的分泌,改善胃黏膜血流量等作用有关[5-6]。本课题组前期研究证实大建中汤治疗脾阳虚腹痛有效,同时能调节炎性因子的含量,表明大建中汤可能对炎症有治疗作用。

图2 大建中汤对大鼠胃组织 IRAK-4 mRNA 表达的影响Fig 2 Effects of Dajanzhong decoction on IRAK-4 mRNA expression in stomach tissue of rats1: Normal control group; 2: Model group;3: Test drug control group; 4: Dajianzhong high-dose group;5: Dajianzhong medium dose group; 6: Dajianzhong small dose group

本研究通过饮食失调、劳倦过度、苦寒泻下等措施,再先后应用40%乙醇和20mmol/L去氧胆酸钠灌胃大鼠,大鼠自由饮用0.1%氨水,之后用0.05%吲哚美辛灌胃,并配以饥饱失常,最终成功制造脾阳虚胃炎模型。本实验也显示,模型组大鼠胃黏膜腺萎缩,呈慢性炎症表现,固有层可见灶性浸润的淋巴细胞,有形成的淋巴滤泡,胃黏膜基层变厚;而大建中汤治疗后大鼠胃黏膜腺体轻度萎缩,黏膜下层轻度增厚,浆细胞、淋巴细胞呈散在浸润。这说明了该方剂治疗胃炎有效。

TNF-α在致炎过程中起重要作用,与炎症活动性呈正相关[7]。IL-6作为前炎症细胞因子,在炎症反应过程中起着重要的作用,是敏感反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标[8]。IL-6、TNF-α等细胞因子作为重要的炎症介质参与机体的炎症反应[9]。生理状态下,人体液中TNF-α和 IL-6水平较低,但在病理状态下,TNF-α和IL-6分泌量增加以及引起的各种炎症因子的瀑布式释放可导致炎症反应,引起组织细胞损伤。

最新研究表明[10],白介素-1受体相关激酶 (IRAK)家族参与炎症反应和机体先天性免疫反应过程,在炎症信号转导通路中起着重要作用。目前研究表明,IRAK-1、IRAK-2、IRAK-4、IRAK-M是IRAK家族中的 4个成员。Rekhter等[11]研究也显示,在HEK293细胞中过表达激酶失活型的IRAK-4与野生型相比,不能激活NF-κB,阻断了IL-1和IL-8的产生。其中,IRAK-4是IRAK家族中最重要的一种激酶,它能激活核因子-κB(NF-κB),活化的NF-κB进入细胞核,引起促炎细胞因子基因的转录和表达,从而使各种炎性细胞因子表达升高[12]。因此,IRAK-4在炎症信号通路和免疫反应过程中的作用较家族其他激酶更为关键。

本实验结果表明,大建中汤能够降低脾阳虚胃炎模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α以及血液单核细胞中IRAK-4 mRNA的水平,提示大建中汤治疗胃炎脾阳虚证的机制可能与降低IL-6、TNF-α、IRAK-4的水平有关。据此,大建中汤治疗脾阳虚胃炎有较大的发展前景,应继续加强对该方治疗炎症的机制研究,并进行深层次的开发利用,以为临床提供科学依据。

参 考 文 献

[1] 武静.大建中汤对脾阳虚腹痛大鼠CaMKⅡmRNA的影响[J].江西中医药,2015,(8)：23-25.

[2] 王慧,武静,陈继婷.脾阳虚大鼠下丘脑星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞OX42的表达及大建中汤的干预作用[J].时珍国医国药,2013,24(2)：304-305.

[3] 王俊霞,陈继婷.大建中汤对脾阳虚疼痛大鼠模型血中NO、β-EP影响的实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(12)：170.

[4] 魏盛,朱德豪,张克升,等.仁青常觉治疗MNNG致大鼠慢性萎缩性胃炎的实验研究[J].中药新药与临床药理,2015,26(1)：54-57.

[5] 沈桢巍,雷撼,高鹏飞.日本汉方大建中汤在消化道外科领域的基础与临床研究进展[J].世界中西医结合杂志,2011,6(3)：261-264.

[6] 赵昌,王卫星.大建中汤治疗胃溃疡的临床疗效观察[J].中医临床研究,2014,6(5)：108-109.

[7] 李卫,刘佳,白家媛,等.α肿瘤坏死因子的研究进展[J].动物医学进展,2010,31(12)：108-110.

[8] 李婷,朱向东,杨意,翟艳会.痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠下丘脑中IL-6,IL-6R表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(11)：103-108.

[9] 杜春艳.大叶性肺炎患儿血清和支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、HMGB1的水平变化及意义[D].西安：第四军医大学,2014.

[10] 李帆,芮耀诚.IRAK4在白介素-1受体/TOII样受体(IL-1R/TLRs)介导的炎症信号通路中的关键作用[J].药学实践杂志,2011,29(1)：1-3.

[11] Rekhter M,Staschke K,Estridge T,et al.Genetic ablation of IRAK4 kinase activity inhibits vascular lesion formation[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,367(3)：642-648.

[12] Kim K J,Yoon K Y,Yoon H S,et al.Brazilein suppresses inflammation through inactivation of IRAK4-NF-κB pathway in LPS-induced Raw264.7 macrophage cells[J].Int J Mol Sci,2015,16(11)：27589-27598.