血浆及唾液中α-突触核蛋白作为帕金森病生物学标记物的研究

牛西远， 吴 蕾， 丁小灵， 赵学军， 尤和阳

帕金森病(Parkinson disease，PD)是中老年常见的神经系统变性疾病。临床上以静止性震颤，运动迟缓，肌强直和姿势步态异常为主要表现。PD的主要病理改变是是以中脑黑质多巴胺能神经元缺失，黑质残存神经元内出现路易小体为主要病理改变的神经退行性疾病。路易小体是PD 的重要诊断特征，其包含多种成分，而相关研究表明α-突触核蛋白是第一个被确认与 PD 相关的蛋白，是路易小体的重要成分之一[1]，α-突触核蛋白与路易小体的形成及PD的发生密切相关。越来越多的证据α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)异常聚集是PD病理学级联反应的关键事件。现有的资料表明α-突触核蛋白异常表达和聚集是PD发病的重要环节。对于PD脑外生物学标记物的研究进展主要集中在血浆、脑脊液、唾液腺等部位[2，3]。既往研究主要集中在脑脊液，取材不便而且影响较大。此外，血浆和唾液较易获取，伤害较小，使其成为检测该标记的理想生物标记物。所以此次我们研究集中在血浆和唾液，我们以PD作为研究对象，以年龄匹配的健康者作为对照，比较血浆及唾液中 α-突触核蛋白有无差异，并比较不同分期、不同病程、疾病进展的PD上述蛋白有无差异，能否成为PD诊断及鉴别诊断、判断病程、分期的指标。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2016年1月～2017年6月省立医院门诊或住院的PD患者30例(PD组)，其中男18例，女17例，平均年龄(63.8±7.3)岁，年龄匹配的健康体检者25例(对照组)，男11例，女14例，平均年龄(64.1±10.8)岁。入选标准：(1)PD组患者符合英国PD脑库的诊断标准；(2)Hohen Yahr分期1～4期；(3)采集EDTA抗凝血样；(4)签署知情意书。对照组为PD患者的健康配偶。排除标准：(1)继发性帕金森综合征患者；(2)其他帕金森叠加综合征患者；(3)符合痴呆诊断标准，临床痴呆量表评分≥1分；(4)头部CT或MRI提示脑内器质性病变者；(5)严重焦虑、抑郁和精神分裂症；(6)合并心脏、肺、肝脏、。肾脏、内分泌、血液系统严重疾病；(7)患有失语、严重构音障碍等影响临床测评的疾病；(8)受唾液腺和口腔病变者；(9)预计依从性较差。

1.2 方法 本研究使用病例报告表，收集患者的基本信息(姓名、性别、年龄)；疾病情况(发病年龄、病程、疾病进展)。我们从每个PD患者和健康受试者收集最少量的3 ml唾液、血浆。在收集唾液样本时，受试者需禁食120 min，在前4 h内没有吸烟，在过去12 h内没有喝酒。 研究中排除了具有血浆污染的样品。 通过指示患者将唾液流入无菌试管中，搜集血浆时禁食水12 h，用无菌试管抽取，在4 ℃下以17000 r/min旋转30 min，收集上清液，转移至干净的管中和唾液一起放置-80 ℃下保存。应用统一PD评定量表运动部分评价PD患者运动症状，用Hoehn-Yahr分期评估患者疾病受累程度。应用双抗体夹心法测定标本中人α-突触核蛋白水平。用纯化的人α-突触核蛋白(α-SYN)抗体包被微孔板，制成固相抗体(中国 博研公司)，往包被单抗的微孔中依次加入α-突触核蛋白，再与辣根过氧化物酶标记的α-突触核蛋白抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 3，3’、5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色。 TMB 在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的α-突触核蛋白呈正相关。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人α-突触核蛋白浓度。

2 结 果

2.1 2组各因素比较 PD组血浆及唾液α-突触核蛋白含量高于对照组(P<0.05)。差异有统计学意义。

2.2 PD血浆及唾液α-突触核蛋白与各因素的相关性 PD组血浆α-突触核蛋白含量与病程(r=-0.025，P=0.888)，Hohen Yahr分级(r=-0.163，P=0.348)，年龄(r=020，P=0.908)，统一PD评定量表运动评分(r=-0.159，P=0.362)，发病年龄(r=-0.034，P=0.848)无相关性。

PD组唾液α-突触核蛋白含量与病程(r=-0.78，P=0.655)，Hohen Yahr分级(r=-0.052，P=0.766)，统一PD评定量表运动评分(r=-0.182，P=0.295)无相关性，与年龄(r=-0.425，P=0.011)，发病年龄(r=-0.336，P=0.048)成负相关。

2.3 ROC曲线分析诊断最佳临界值 应用血浆α-突触核蛋白作为PD标记物诊断PD诊断ROC曲线下面积为0.727(P=0.003)，最佳临界值为157.86 ng/L，敏感性为68.60%，特异性为72.00%。唾液α-突触核蛋白作为诊断指标，ROC曲线下面积为0.785(P=0.00)，最佳临界值为211.14 ng/L，敏感性为82.90%，特异性为80.00%。

表1 2组间各因素比较

注：与对照组比较，P<0.05

图1 唾液α-突触核蛋白

图2 血浆α-突触核蛋白

3 讨 论

α-突触核蛋白为正常人脑组织中一种可溶性蛋白，α-突触核蛋白在正常生理状态下并没有细胞毒性，环境或者基因的改变易引起α-突触核蛋白发生错误折叠，出现寡聚体，纤维性蛋白逐渐增多，继而形成路易小体，PD的主要病理特征之一是路易小体的出现，其主要成分是α-突触核蛋白沉积，最终多巴胺神经能细胞程序性死亡使患者出现PD症状，随着检测技术的提高，在脑积液、血浆、唾液中均可以检测出α-突触核蛋白，且发现PD患者体内α-突触核蛋白较正常对照组存在差异。Duran等[4]研究发现，53例未予治疗与42例接受治疗的PD患者血浆中α-突触核蛋白水平相似，均高于对照组，且在该研究中指出在早期疾病的阶段α-突触核蛋白水平的升高，不受抗PD药物的影响。国内也有研究报道，PD患者血浆中α-突触核蛋白寡聚体水平明显高于对照组[5]，唯一描述PD中血浆α-突触核蛋白水平降低的文献[6]使用了较前不同的技术，即重组α-突触核蛋白在大肠杆菌中表达和免疫印迹定量。而与本实验结果相同的上述几组实验均采用ELISA方法，相比上述方法，ELISA法的定量更具体，在比较健康对照组和PD患者之间的血浆α-突触核蛋白中，更容易量化，结果更线性。虽然有些作者报道说血细胞没有合成α-突触核蛋白[6]，但 Barbour等[7]尽管只研究了4个人(健康)，他们仍认为红细胞可能是血浆α-突触核蛋白的主要来源。最近的一项研究表明，α-突触核蛋白通过静脉注射的形式通过血脑屏障进入中枢神经系统致病，这表明血细胞表达的α-突触核蛋白在PD发病过程中起潜在作用[8]。PD的病因有老龄化和α-突触核蛋白，但它们之间的关系也是充满争议，我们的研究结果显示血浆α-突触核蛋白与年龄无关，与以前的研究一致[7]。Yanamandra等认为神经元的死亡或轴突的损伤突触末端可导致可溶性的释放α-突触核蛋白的聚集形式细胞外，是α-突触核蛋白生理分泌到细胞外环境的证据[9]。尽管原因不明确，而且我们没有在其他神经系统疾病中研究α-突触核蛋白水平。因此我们不能提出血浆α-突触核蛋白作为特定的生物标志物。本实验在35个PD患者中检测到血浆α-突触核蛋白明显高于对照组，表明血浆α-突触核蛋白在PD中仍有它的诊断价值。

相对于血浆、脑脊液等，唾液更具有简便、经济、安全无创等优势[10]，有研究表明颌下腺α-突触核蛋白病理学检测对于PD诊断的特异性及敏感性达100%[11]，而颌下腺已被证明参与帕金森病的早期阶段[12，13]。既往资料表明人类颌下腺在静息下产生的唾液占总体积的60%和65%[14]，因此我们选择唾液中α-突触核蛋白作为帕金森病诊断的潜在生物标志物是具有前景的领域。本实验运用ELISA方法分析35例PD患者及25例对照组唾液中α-突触核蛋白的含量，结果显示PD患者唾液α-突触核蛋白明显低于对照组水平，差异有统计学意义，在本研究中健康受试者与PD之间的年龄无明显差异。因此，老龄化对唾液决定因素的影响并不偏离本研究获得的结果。Devic等[15]报道与对照组相比，帕金森病患者唾液α-突触核蛋白水平明显降低，此外，该研究发现帕金森病患者唾液α-突触核蛋白水平与UPDRS(统一帕金森氏病评分量表)运动评分之间的差异，表明其α-突触核蛋白水平与运动症状严重程度呈负相关，但效果未达到显著性，与本实验一致。且他们证实唾液腺与中枢神经系统相关，并参与帕金森病相对较早的疾病阶段[13]，这也解释了其唾液α-突触核蛋白与发病年龄和年龄成负相关这一现象[16]，这与本研究一致(r=-0.425，P=0.011)，Al-Nimer等[17]基于20例PD患者也报道唾液中的α-突触核蛋白水平显著低于健康受试者，与本实验一致的是Devic等[15]和Al-Nimer等[17]这两项研究均针对少数PD患者进行的，这是实验不足之处，但Vivacqua等[18]在2016报道出在60例PD患者和40例健康受试者相比，PD患者唾液中的α-突触核蛋白仍减少。这个发现与以前两次相对较少数据的观察结果完全一致，相对于上述几项研究，本实验更能代表东方人群唾液α-突触核蛋白特点。神经病理学研究表明，在PD的早期阶段，聚集α-突触核蛋白的细胞主要分布于包括孤束核、迷走神经背核的脑干神经核里[19]，也可能是在上、下唾液核和副交感唾液神经节里面。这提示α-突触核蛋白可能从唾液神经元的神经元细胞体中扩散出来，沿轴突，到唾液腺上皮细胞周围的突触末端，聚集在唾液腺及唾液中[20]。因此，PD患者唾液中检测到的总α-突触核蛋白浓度降低可能是由于唾液核或唾液神经节神经元中α-突触核蛋白的细胞内和轴突聚集，这可能是PD唾液α-突触核蛋白浓度较正常对照组低的原因。

综上所述，应用唾液α-突触核蛋白诊断PD的ROC曲线方面，敏感性、特异性及阳性预测值均比血浆α-突触核蛋白均高，可更适合作为诊断PD的指标。本研究发现年龄、发病年龄与PD唾液α-突触核蛋白成负相关，可能与唾液腺萎缩后分泌不足有关，期待以后更多研究证实。

[参考文献]

[1]Goedert M，Spillantini MG，Del Tredici K，et al. 100 years of Lewy pathology [J]. Nat Rev Neurol，2013，9(1)：13-24.

[2]Lindqvist D，Hall S，Surova Y，et al. High CSF A-synuclein is associated with clincal progression in PD patients [J]. Alzheimers Dement，2014，10(4)：353-353.

[3]Folgoas E，Lebouvier T，Visonneau L，et al. Diagnostic value of minor saliwary gland boopsy for the detection of Lewy pathology[J]. Neurosci Lett，2013，551：62-64.

[4]Duran R，Barrero FJ，Morales B，et al. Plasma alpha—synuclein in patients with Parkinson’s disease with and without treatment [J]. Mov Disord，2010，25(4)：489-493.

[5]陈 敏，孙 涛，陈 艳，等. 不同Hoehn-Yahr分级帕金森病患者血浆a一共核蛋白的研究[J]. 卒中与神经疾病，2015，22(6)：323-326.

[6]Li QX，Mok SS，Laughton KM，et al. Plasma a-synuclein is decreased in subjects with Parkinson’s disease [J]. Exp Neurol，2007，204(2)：583-588.

[7]Barbour R，Kling K，Anderson JP，et al. Red blood cells ale the major source of alpha-synuclein in blood[J]. Neurodegener Dis，2008，5(2)：55-59.

[8]Peelaerts W，Bousset L，Van der Perren A，et al. Alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration [J]. Nature，2015，522(7556)：340-344.

[9]Yanamandra K，Gruden MA，Casaite V，et al. A-synuclein reactive antibodies as diagnostic biomarkers in blood sera of Parkinson’s disease patients [J]. PLOS One，2011，6(4)：e18513.

[10]Zhang A，Sun H，Wang X，Saliva metabolomics opens door to biomarker discovery，disease diagnosis，and treatment [J]. AppI Biochem Biofechnol，2012，168(6)：1718-1727.

[11]MaIek N，Swallow D，Grosset KA，et al. Alpha-synuclein in peripheral tissues and body fluids as a biomarker for Parkinson’s disease-asystematic review[J]. Acta Neurol Scand，2014，130(2)：59-72.

[12]Beach TG，Adler CH，Dugger BN，et al. Submandibular gland biopsy for the diagnosis of Parkinson disease[J]. J Neuropathol Exp Neurol，2013，72(2)：130-136.

[13]Del Tredici K，Hawkes CH，Ghebremedhin E，et al. Lewy pathology in the submandibular gland of individuals with incidental Lewy body disease and sporadic Parkinson’s disease[J]. Acta Neuropathol，2010，119(6)：703-713.

[14]张国禾. 唾液腺生物学. 第2版[M]. 北京：人民卫生出版社，2014. 21-111.

[15]Devic I，Hwang H，Edgar JS，et al. Salivary alpha-synuclein and DJ-1：potential biomarkers for Parkinson’s disease[J]. Brain，2011，134(Pt 7)：e178.

[16]张 佳，康文岩，刘 军. 帕金森病α-突触核蛋白与非运动症状的相关性研究与纹状体多巴胺摄取功能的相关性研究[J]. 临床内科杂志，2017，34(1)：45-48.

[17]Al-Nimer MS，Mshatat SF，Abdulla HI，Saliva a-synuclein and a high extinction coefficient protein：a novel approach in assessment biomarkers of Parkinson’s disease[J]. N Am J Med Sci，2014，6(12)：633-637.

[18]Vivacqua G，Latorre A，Suppa A，et al. Abnormal salivary total and oligomeric alpha-synuclein in Parkinson’s disease[J]. PloS One，2016，11(3)：e0151156.

[19]Cersosimo MG，Benarroch EE. Pathological correlates of gastrointestinal dysfunction in Parkinson’s disease[J]. Neurobiol Dis，2012，46(3)：559-564.

[20]Cersosimo MG，Raina GB，Pecci C，et al. Gastrointestinal manifestations in Parkinson’s disease：Prevalence and occurrence before motor symptoms[J]. J Neurol，2013，260(5)：1332-1338.