BRAF基因在甲状腺癌中的表达及临床相关性研究

宋传伟

甲状腺癌属于常见的内分泌恶性肿瘤之一，包括乳头状癌、未分化癌、滤泡状癌以及髓样癌，且以乳头状癌发生率最高，大约占所有甲状腺癌的85%[1]。目前，甲状腺癌的发病率逐年升高，尤其乳头状癌的发生情况最为明显。甲状腺癌治愈率也比较低，大多数患者会发生疾病复发、并发症、癌组织远处转移等后遗症，因此甲状腺癌的治疗也越来越受到人们的关注[2]。本院在对甲状腺癌以及良性甲状腺病变患者的诊治过程中，分析BRAF基因突变与甲状腺癌的发病机制、病理性特征、治疗、诊断的临床相关性，取得了满意效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年7月～2017年7月本院收治的甲状腺癌患者40例，其中男23例，女17例，年龄25～76岁，平均年龄（53.2±2.4）岁，乳头状癌25例，滤泡状癌8例，未分化癌7例，肿瘤直径＞1 cm有24例，≤1 cm有16例；同期收治的良性甲状腺病变患者32例，其中男15例，女17例，年龄31～74岁，平均年龄（48.5±3.2）岁，甲状腺结节15例，甲状腺腺瘤8例，甲状舌管囊肿9例。两组患者临床资料比较差异无统计学意义，均知情同意本研究，并经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法 研究组与对照组患者均采用以下的两种方法分别观察其BRAF基因突变情况以及BRAF蛋白表达情况。

1.2.1 BRAF基因突变情况 采用PCR扩增技术并通过测序仪对PCR扩增产物进行序列测定。首先进行DNA的提取，将8μm厚的石蜡组织进行切片处理，切分为3～4片，将其放置于1.5 ml专用试管中，将含有DNA的石蜡切片抽提试剂盒进行样本提取，使用NanoDrop进行DNA的浓度测定，均按照试剂盒操作说明书进行[3]。其次进行引物合成，引物合成后，采用巢式PCR扩增技术进行BRAF基因的扩增。扩增完成后，取8μl PCR扩增产物，2%的琼脂糖凝胶，1μl缓冲液，在100 V电压下进行30 min的电泳操作，EB进行染色处理，将PCR产物纯化后，使用引物BRAF-F或BRAF-R进行测序，并将测序结果通过Blast软件与已知序列进行同源性比较，观察BRAF基因突变情况[4]。

1.2.2 BRAF蛋白表达情况 采用免疫组化Envision两步法，将4μm厚石蜡切片，石蜡进行常规脱至水处理，置于放有柠檬酸修复液的电饭煲中，煮沸20 min，然后将其降至室温状态，再滴加稀释程度为（1∶100）的抗BRAF抗体，培养3 h，用PBS清洗3次，发现DAB正常显色，再次用苏木精染色一遍，脱水至透明封固处理[5]。观察分析BRAF蛋白表达中的阳性率与阴性率。

1.3 观察指标 通过将PCR扩增产物与基因库中的序列进行比较，观察BRAF突变情况。BRAF蛋白表达阳性与阴性判断标准：肿瘤细胞核染色后为棕黄色，随机观察切片的5个视野，阳性细胞数占肿瘤细胞总数得百分比≥10%为阳性，即为甲状腺癌，阳性细胞数或无着色细胞数＜10%为阴性，即良性肿瘤。

1.4 统计学方法 本研究采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计数资料以例数表示，采用χ2检验；计量资料采用“x±s”表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组中甲状腺乳头状癌25例，有15例发生了基因突变，滤泡状癌与未分化癌没有发生基因突变。对照组中均无基因突变发生，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

研究组患者的BRAF蛋白表达率水平明显高于对照组（P＜0.05），且研究组BRAF蛋白阳性者28例，阳性率为70.0%，表达阴性者12例，阴性率为30.0%，对照组BRAF蛋白表达阳性者8例，阳性率为25.0%，表达阴性者24例，阴性率为75.0%，见表1。

表1 两组患者BRAF蛋白表达水平对比[n（%）]Table 1 Comparison of BRAF protein expression levels in the two groups[n(%)]

3 讨论

BRAF基因，又称鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，属于RAF基因家族中的一种，位于人染色体的7q34，约190 KD大小，有94 KD能够编码蛋白质分子，且含有18个外显子，783个氨基酸残基，对MAPK信号通路的传导有重要作用，其基因突变对于多种癌的形成均有诱导作用，甲状腺癌是其中之一[6]。RAS和RET的下游蛋白激酶是BRAF，在15外显子基因中的单个碱基发生突变（T1799A），会造成谷氨酸替代翻译蛋白质的密码子相对应的缬氨酸（V600E)，使之变成活化的蛋白激酶，从而将MEK（ERK激酶）激活以及向MAPK信号通路下游传递有丝分裂信号的细胞，致使肿瘤的形成。MAPK是一种信号通路，能够对细胞的生长、繁殖、分化、凋亡起重要调控作用，影响细胞的生命周期，当它被某种因素影响导致其异常激活时，可能会促使肿瘤的形成[7]。

BRAF基因合并PTEN、RAS等基因突变通常发生在浸润性甲状腺癌中，尤以甲状腺乳头状癌的发生最为常见，甲状腺癌发生的重要机制之一是抑癌基因发生异常甲基化从而诱导基因沉默的发生，并使肿瘤进一步恶化。研究学者在对甲状腺乳头状癌患者的研究中发现，RASSR1A抑癌基因超甲基化与BRAF基因突变具有负相关的关系，这或许暗示着BRAF基因的后天破坏可能将通过影响信号通路（MAPK通路）来诱导甲状腺癌的形成。最新的研究表明，BRAF基因突变能够诱导转化生长因子TGF-β的分泌以及抑制素（PHB）的分泌，且BRAF基因突变能够提高抑制素释放素的活性，促进PHB的分泌，抑制素能够潜在的对BRAF基因突变进行调节，从而促使甲状腺乳头状癌的发生。BRAF基因突变经研究证实，与患者的年龄、性别、淋巴结转移、原发灶大小、甲状腺外侵犯以及肿瘤大小和分期没有明显相关性，其突变的主要原因有：①BRAF基因的异常剪接。BRAF基因的异常剪接是引起BRAF基因活化的重要诱因，研究学者通过调查甲状腺癌患者的肿瘤组织发现，BRAF基因突变都能够检测到，且在甲状腺乳头状癌患者中的Ⅲ期、Ⅳ期显著高于Ⅰ期、Ⅱ期，这种异常现象的出现与肿瘤的分期、BRAF突变有明显关系。②辐射。辐射是一种重要的致癌剂，其与DNA分子相互作用，能够使DNA分子双链裂变，导致基因重排，遭受辐射的细胞会造成基因组出现不稳定性，且相邻的细胞即使未被辐射也会出现相同的现象，这便是旁观者效应，最终会导致肿瘤原癌基因与抑癌基因发生变化，致使肿瘤形成[8]。致癌基因的重排包括原癌基因和抑癌基因，也包括BRAF基因的重排。有研究调查发现，在切尔诺贝利核事故发生后的20多年，当地居民甲状腺癌的发病率增加较快，表明射线暴露也是导致甲状腺癌的危险因子。③大量的碘摄入。研究学者通过考察分析，发现高碘摄入区比正常的碘摄入区发生BRAF基因突变的突变率要高很多，以此证明，大量碘的摄入也是一个诱导因素[9]。

虽然BRAF基因突变会诱导甲状腺癌的形成，但其也具有重要的临床医学价值，对于甲状腺癌的诊治和预后有重要的作用。通过本次研究表明，BRAF基因突变率为60%，其中甲状腺乳头状癌突变率最高，且在其他甲状腺癌和良性甲状腺病变中并未发生基因突变，国内外的文献报道称BRAF基因在甲状腺乳头状癌中的突变率为28.4%～66.7%，本次研究结果与报道上大体上一致，表明BRAF基因是甲状腺癌的特异基因，因此可作为诊断甲状腺癌发生的一个标志物[10]。本次研究结果显示，研究组患者的BRAF蛋白表达率水平明显高于对照组（P＜0.05），表明甲状腺癌患者体内BRAF基因蛋白表达更为显著，肿瘤细胞繁殖率较高。对于甲状腺癌的治疗，可以通过研究某种抑制药物，使其能抑制MAPK信号通路的异常激活，或者使某种抑制药物能够抑制乳头状癌肿瘤细胞的增殖，可能将会有效治疗甲状腺癌，治疗效果还有待于进一步研究。

综上所述，BRAF基因突变与BRAF蛋白表达为阳性都会诱导甲状腺癌的发生，成为难以根治的恶性肿瘤，但其在甲状腺癌的诊治及预后中也发挥了辅助价值，有利于为临床应用BRAF基因突变诊断甲状腺癌和患者的预后工作提供理论依据，其临床价值仍需要进一步研究发展。

参考文献

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