不同盐浓度豆豉在发酵过程中抗氧化活性的变化

朱江煜，欧一琛，费立天

(扬州大学 食品科学与工程学院 营养与食品卫生学专业，江苏 扬州 225000)

豆豉是一种以黑豆或黄豆为主要原料的传统发酵食物，口味独特，营养丰富，其中含有多种抗氧化成分，除少量的生育酚和维生素C外，还含有黄酮类和酚酸类化合物，以及在发酵过程中产生的多肽类和褐色色素类物质等[1,2]。随着人们生活质量和消费水平的提高，豆豉的生理保健功能越来越受到消费者的重视，特别是抗氧化功能。有研究表明不同盐浓度会对豆豉发酵的过程有所影响，从而导致抗氧化活性的变化。盐浓度低，发酵周期短，产品易受微生物污染。盐度太高则周期长，且盐分含量高对健康不利，不为广大消费者接受，因此合适的食盐含量是发酵调味品生产的关键[3,4]。为了在发酵过程中更好地保证豆豉的抗氧化活性，本研究以黑豆为原材，研究了不同盐浓度下，豆豉发酵过程中黄酮总量、铁还原能力、羟自由基清除能力及DPPH自由基清除能力的变化，从而为豆豉工业化生产工艺优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：新鲜黑豆、食盐，均为市售；米曲霉菌，来自扬州大学微生物实验室。

1.2 试验试剂

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、硝酸铝、醋酸钾，均为分析纯。

1.3 仪器与设备

TG328型分析天平、5415D型台式离心机、YQ-120A型超声波振荡仪、HQ11D型便携式pH、G100/G200型水平式恒温水浴锅、101-1型干燥箱、722N型分光光度计、6202型多功能粉碎机。

1.4 试验方法

1.4.1 不同盐浓度的豆豉的制作

取1.5 kg黑豆洗净，常温下浸泡7 h，放入灭菌锅内，在121 ℃下加热30 min，降温到40 ℃待用，然后分成4组，每组600 g蒸熟的黑豆，按4%，8%，12%，16%的盐浓度加入食盐，然后按黑豆重的0.2%接入米曲霉菌三级种，搅拌均匀后立即取样，其余样放入35 ℃恒温箱内，每隔3天取1次样，第15天结束采样。

1.4.2 样液的准备

将样品从恒温箱中取出，初步捣碎后放入鼓风烘箱内50 ℃恒温干燥3～4 h，直至样品水分低于10%后取出，用多功能粉碎机粉碎，按质量比1∶30的比例加入80%的乙醇，进行超声提取30 min，离心后过滤，得待测样液[5]。

1.4.3 黄酮总量的测定

黄酮类化合物和芦丁母核相似，吸光度测试效果相同，故用芦丁标准曲线计算黄酮总量。

取5 mg芦丁对照品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得标准溶液。精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，加入到10 mL容量瓶中，加蒸馏水补足，使各容量瓶中均含有5 mL液体，然后精密称取0.3 mL浓度为5%的亚硝酸溶液，混匀放置5 min后加入0.3 mL浓度为10%的硝酸铝溶液，再次放置5 min后，加2 mL浓度为4%的氢氧化钠溶液，添加蒸馏水至容量瓶刻度线定容，再静置10 min后，以无芦丁样为空白，在510 nm处测定吸光度值，绘制芦丁标准曲线。

吸取待测标准液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶液至总体积为15 mL，依次加入硝酸铝溶液1 mL、醋酸钾溶液1 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，最后静置1 h；以空白试液(精密吸取待测试料溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加95%的乙醇溶液至总体积为15 mL，加水至刻度，摇匀)做参比，在415 nm处测定试料溶液的吸光度；根据所得标准曲线，按下式计算总黄酮含量[6]：

M=(m×d)/W。

式中：M为黄酮类化合物的总含量，mg/g；m为由标准曲线上查出的样品比色液中芦丁质量浓度，mg/mL；W为样品的质量，g；d为稀释比例。

1.4.4 铁还原能力的测定

取2支试管，均加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH为6.6)和0.5 mL测试液，其中一支中加入2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，另一支中加入2.5 mL蒸馏水，摇匀后在50 ℃下水浴30 min，快速冷却后均加入2.5 mL 10%三氯乙酸，然后放入离心机中在3000 r/min下离心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL水以及0.5 mL 0.1%氯化铁，静置10 min后于700 nm处测定吸光度值，其中加铁氰化钾的样液吸光度值记为Aa，加水的吸光度值记为Ab。

最后，Aa-Ab得到的吸光度差值At可以用来判断铁还原能力的强弱：差值越大，铁还原能力越强；差值越小，铁还原能力越弱。

1.4.5 羟自由基清除能力的测定

取3支10 mL比色管，第1支中加入0.5 mL的 10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL的 10 mmol/L 硫酸亚铁、0.5 mL的待测液、8 mL的水和0.5 mL的10 mmol/L过氧化氢，摇匀，室温放置20 min，在510 nm处测定吸光度值，记为Ax。第2支中以0.5 mL样品提取液溶剂代替待测液，第3支中以0.5 mL水代替过氧化氢，其余同第1支，吸光度值分别记为A0和Ax0。羟自由基清除率的计算公式如下[7]：

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100。

1.4.6 DPPH自由基清除能力的测定

在试管中依次加入0.5 mL样品提取液溶剂、3 mLDPPH产酸性蛋白酶乙醇溶液，混匀，避光，25 ℃水浴30 min，取出后在517 nm处测吸光度，记为Ai；以0.5 mL样品加入3 mL无水乙醇按上述方法测吸光度，记为Aj；以0.5 mL溶剂加入3 mL DPPH乙醇溶液按上述方法测吸光度，记为Ac。测得数据后，清除率K的计算公式如下[8]：

K(%)=[Ac-(Ai-Aj)]/Ac×100。

1.5 数据处理

所有数据通过SPSS 19.0进行处理，实验重复3次，数据以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 黄酮总量的变化

根据分光光度计测得数据，绘制芦丁标准曲线，见图1。根据标准曲线，计算出待测液中的黄酮总量，见图2。

图1 芦丁标准曲线

图2 不同盐浓度豆豉发酵过程中黄酮总量

由图2可知，同一盐浓度的豆豉在发酵过程中其黄酮总量基本不变；不同盐浓度豆豉的黄酮总量变化也不显著。黄酮总量在1.51～1.78 mg/g之间，基本上处于不变的状态，与前人结果相似[9]，细微的差异可能取决于原料豆的种类及酵母菌的差异。

尽管在本实验中发酵前后不同盐浓度豆豉中黄酮总量并未发生明显的变化，但根据宋永生等的研究[10]，发酵处理会导致豆豉中异黄酮成分的改变，经过发酵处理的豆豉中黄豆苷元、染料木黄酮的含量会明显增加，而黄豆苷、染料木苷的含量明显降低。我们推断，之所以发酵过程中黄酮总量最后没有发生变化，可能是黄豆苷元、染料木黄酮的增加，抵消了黄豆苷、染料木苷的降低，最终导致黄酮总量基本没受盐浓度和发酵时间的影响。

虽然发酵处理对豆豉中异黄酮含量的影响并不显著，但据报道，发酵作用下，糖苷型大豆异黄酮在β-葡萄糖苷酶的帮助下会部分转化为游离型大豆异黄酮，使得游离型大豆异黄酮的含量明显提高，糖苷型大豆异黄酮含量明显降低。由于游离型大豆异黄酮的生物活性比糖苷型大豆异黄酮要高，所以发酵处理其实对于提高豆豉中黄酮物质的生理活性十分有效；但随着盐浓度的升高，β-葡萄糖苷酶活性会受到抑制，游离型异黄酮含量降低，导致大豆异黄酮的生物活性也发生降低。所以，在发酵处理中，盐度尽管对豆豉黄酮总量并未发生影响，但生物活性却会受到影响。

2.2 铁还原能力的变化

铁还原能力由2组溶液测得的吸光度Aa和Ab的差值At来判断。差值At越大，铁还原能力越强；差值At越小，铁还原能力越弱。根据得到的数据，绘制成图3。

图3 不同盐浓度豆豉发酵过程中铁还原能力的变化

由图3可知，在同一盐浓度下，随着发酵过程的进行，豆豉的铁还原能力会逐渐变强；处于同一发酵时间，豆豉的铁还原能力会随着盐浓度的提升而下降。

各盐浓度最后一次取样时，吸光度差值均远高于发酵初期，原因可能在于发酵过程中，微生物在酶的帮助下不断产生黄酮类和酚酸类化合物、还原性糖以及多肽类和褐色色素类物质，它们不断增加，导致铁还原能力在发酵过程中不断加强[11]。

此外，在同一时间，低盐浓度发酵的豆豉其铁还原能力显著高于高盐浓度发酵。4%盐浓度的豆豉在第15天取样时，其铁还原能力最强，吸光度差值达到了0.637；而同一时间16%盐浓度的豆豉其吸光度差值仅为0.475。因为盐浓度越高，酶活性降低，对微生物抑制越强，导致高盐浓度豆豉中的还原性糖和酚类物质比低盐浓度豆豉中的含量少很多，而还原性糖和酚类物质对铁还原能力有促进作用，所以铁还原能力也发生下降。

2.3 羟自由基和DPPH自由基清除能力的变化

羟自由基是一种在机体内危害作用最大的活性氧自由基，羟自由基清除率是反映豆豉抗氧化能力的重要指标[12]。在本实验中，采取水杨酸法来测定羟自由基的清除能力，结果见图4。

图4 不同盐浓度豆豉发酵过程中羟自由基清除能力的变化

由图4可知，在同一盐浓度情况下，豆豉发酵时间越长，羟自由基清除能力越强；而同一发酵时间，豆豉的羟自由基清除能力随着盐分的提升而变弱。在第15天时，4%盐浓度的豆豉提取物的羟自由基清除率为35.72%，而16%盐浓度的豆豉提取物中，其羟自由基清除率仅为22.32%。

图5 不同盐浓度豆豉发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化

DPPH自由基清除能力的变化也基本一致。由图5可知，刚蒸煮完毕的黑豆(0 天)及发酵处理15 天后的豆豉对DPPH自由基均有一定的清除效果，而发酵处理过的豆豉提取液的清除率远远高于未发酵的黑豆。这表明在黑豆及豆豉中，都存在着能够作为电子供体的抗氧化性物质，从而与自由基反应使其结构稳定，中止自由链反应，减少破坏，而在发酵过的豆豉中，这些抗氧化物质的含量或种类是高于未经发酵的豆豉的。此外，与羟自由基清除实验相似，在高盐度下，豆豉的DPPH自由基清除能力也发生了降低，4%盐浓度豆豉浸提液的DPPH自由基清除率高达58.67%，而16%盐浓度中仅为36.35%，证明过量的盐浓度可能会对这些抗氧化物质的含量和种类产生一些负面影响。

存在于黑豆中可清除自由基的成分有黄酮类和酚酸类化合物等。黑豆在曲霉发酵过程中进一步产生抗氧化物质，黑豆中的蛋白质和碳水化合物在多种酶的作用下进一步分解为多肽类、褐色色素类物质和还原性糖，此外，那些黄酮类化合物在β-葡萄糖苷酶的作用下会部分转化为游离型异黄酮，其生物活性比糖苷型异黄酮要高[13]。这也解释了发酵15天的豆豉的自由基清除能力高于未经发酵的黑豆的原因。此外，盐浓度也是影响豆豉自由基清除能力的关键，高盐浓度下，许多酶和微生物受到抑制，这些清除自由基的活性物质的产生也会相应减少[14]。

3 结论

在本实验中，通过不同盐浓度豆豉发酵前后黄酮总量、铁还原能力、羟自由基及DPPH自由基清除实验，最终得出以下结论：

豆豉在发酵过程中，其抗氧化活性得到很大的提升。

低盐浓度发酵的豆豉的抗氧化性优于高盐浓度的，本实验中最佳盐浓度为4%，在发酵15天后各抗氧化性指标达到最高，黄酮总量为1.62 mg/g，铁还原实验吸光度差值为0.637，羟自由基清除率达到35.72%，DPPH自由基清除率达到58.67%。

低盐发酵避免了高盐量对身体的不利影响，同时也保证了豆豉抗氧化性的最佳状态，但低盐发酵也会面临着发酵周期长，不易保藏，风味易受到影响的问题，我们正致力于进一步优化豆豉的低盐发酵，在保证生理活性的同时，也可以兼顾其他品质的要求，以更好地适应豆豉的商品化和市场化[15]。

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