左炔诺孕酮和炔雌醚对布氏田鼠繁殖的影响

施玉华,王白石，孙 红，季志鸿，王振龙**

(1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001; 2.公安部物证鉴定中心，北京 100038)

鼠类是重要农林生物灾害，我国年均农业鼠害发生面积约4 000万hm2，粮食损失超过100亿kg，年经济损失80亿～100亿元[1-2]。目前，鼠害治理的措施与方案主要有物理(器械)灭杀、化学药物灭杀、生态控鼠、生物防治等不同形式[3]。近年来，综合多学科的方法和手段，以生态安全为基础的综合控制(Integrated pest management,IPM)逐渐成为鼠害控制的发展方向，其中，不育控制技术(Fertility control technologies)备受关注。不育控制的原理是通过不育剂改变雌鼠或雄鼠的生理代谢水平，阻断雌鼠的生殖激素分泌，使受精卵无法着床或阻止胚胎发育，从而降低种群数量的增长[4-5]。从生态学角度考虑，使鼠不育被认为比传统的毒杀方法更有潜力[6-8]。

左炔诺孕酮(L)和炔雌醚(Q)分别是人工合成的孕激素和雌激素，多用于人类和啮齿类的避孕药[9-11]。以L和Q为主要成分的EP-1可抑制多种啮齿动物的生殖[12-13]。鼠种和剂量对EP-1的不育效果影响较大[14-18]，不育效果还存在可逆现象，动物后期恢复繁殖能力[19-20]。EP-1对雄性鼠类的作用较为一致，即显著降低雄性鼠类的睾丸、附睾、精囊腺质量[12，14]，其中发挥主要作用的是Q成分[11]。目前，不育剂对雌性鼠类的作用则存在争议。Q可抑制雌性的繁殖，降低血清雌二醇和孕酮水平，抑制卵巢中卵泡的成熟和排卵[21]，也有研究显示，Q显著提升雌二醇、孕酮水平[22]；L的作用不大[23]。

布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)隶属于啮齿目(Rodentia)、仓鼠科(Cricetidae)、毛足田鼠属(Lasiopodomys)[24]，是我国北方农、林、牧交错区主要害鼠之一[25]。对布氏田鼠的研究主要涉及婚配制度、气味识别、种群结构与生活习性、择偶、繁殖、能量代谢、产热机制、日食量、代谢率、危害和控制等方面[26-28]。有关布氏田鼠的不育控制技术研究发现，EP-1可导致雄性布氏田鼠的生殖器官萎缩，对雌鼠则无明显的影响[29]，其中Q可有效降低布氏田鼠的总产仔数[30]。

本研究以布氏田鼠为对象，在实验室设置L(+/-)×Q(+/-)双因素试验，连续7 d以灌胃法给药，剂量2 mg/kg。灌胃试验完成后配对饲养，记录动物体质量与繁殖情况，30 d后解剖动物，测定繁殖器官质量和血清激素水平，旨在明确L和Q对布氏田鼠繁殖的影响。

1 材料和方法

1.1 试验动物与饲养管理

选择成年布氏田鼠(由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所提供)，90～120日龄，体质量40～60 g，分为L-Q-(对照)、L+Q-、L-Q+、L+Q+4组，每组7对。灌胃结束前单只饲养于聚苯乙烯标准饲养笼(37 cm×26 cm×17 cm)中，以锯末为垫料，脱脂棉为巢穴，室温控制在20～25 ℃，光照控制为14L∶10D，每天10:00—10:30供以充足的兔颗粒饲料(河南省实验动物中心生产)和洁净的饮用水，灌胃试验完成后配对饲养。

1.2 不育剂配制与给药方式

本研究选用L、Q以及二者1∶1的混合物(购自大连美仑生物科技有限公司)作为3个给药组药物，将三者都溶于20% 2-羟丙基-β-环糊精(HPCD)(购自山东滨州智源生物科技有限公司)中，质量浓度均为0.5 mg/mL，每个给药组配制50 mL，放置于4 ℃。

每天9:00给药，采用12号弯头灌胃针、1 mL注射器，灌胃剂量为2 mg/kg，连续7 d给药。

1.3 测定项目及方法

灌胃前及灌胃结束后7、14、21、28 d分别称量动物体质量。灌胃结束后30 d，解剖动物，统计田鼠的怀孕率、胎仔数、畸形率等情况，解剖雄鼠取睾丸、附睾，雌鼠取子宫、卵巢，称质量。

眼球取血，0.5 mL EP管取血0.3～0.5 mL，常温下静置2 h，然后3 500 r/min离心10 min，用移液枪小心吸取上层血清，放于-20 ℃，待酶联免疫分析。采用大鼠皮质酮检测试剂盒、促卵泡生成素检测试剂盒、雌二醇检测试剂盒和睾酮检测试剂盒(均购自上海沪震生物科技有限公司)测定各种激素的含量。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 18.0软件包进行统计分析。器官指数=器官质量/体质量×100%，采用2×2列联表的精确检验法计算怀孕率的概率值，体质量、器官指数、激素水平则利用重复测量广义线性模型进行分析，结果采用平均值±标准误表示，多组间均数比较时，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不育剂对布氏田鼠体质量的影响

从图1可以看出，不同类型的不育剂对布氏田鼠体质量的影响不同。利用广义线性模型分析得知，灌胃后经过28 d的饲养，L对布氏田鼠体质量变化率的影响不显著(F1，106=3.086，P=0.082)，Q则可显著降低动物的体质量(F1，106=11.394，P=0.01)，其中灌胃后14 d达到最低，比灌胃前体质量降低了18.16%(F3，106=2.062，P=0.031)，灌胃后21 d与28 d则逐渐恢复。说明Q可显著降低布氏田鼠的体质量，而L则不能。

图1 不育剂对布氏田鼠体质量变化率的影响

2.2 不育剂对布氏田鼠繁殖参数的影响

L和Q均显著抑制布氏田鼠的繁殖，对照组个体怀孕率为85.70%(12/14)，L+Q-组则仅为 7.14%(1/14)(df=1，P=3.44E-5)，其他2组均无怀孕个体(df=1，P=2.99E-6)。对照组平均胎仔数为5.67±0.62(n=12)，L+Q-组仅有1只怀孕，胎仔数为8。

2.3 不育剂对布氏田鼠器官指数的影响

不育剂对布氏田鼠的器官指数影响不同(表1)。L对子宫指数抑制作用不显著；Q则存在显著的降低作用，当L不存在时，Q对子宫指数的降低作用为64.20%，当L存在时，Q的降低作用为30.56%；二者不存在显著的交互作用。L和Q对卵巢指数的影响不显著，二者也不存在显著的交互作用。当Q不存在时，L对睾丸指数的降低作用仅为2.11%，而当Q存在时，L对睾丸指数的提升作用达到了66.67%，总体上L显著升高睾丸指数；Q则显著抑制睾丸指数，当L不存在时，Q对睾丸指数的抑制作用达到了43.16%，当L存在时，Q的抑制作用降为3.22%；二者存在显著的交互作用。L显著升高附睾指数，当Q不存在时，L的升高作用为18.18%，当Q存在时，L的升高作用则达到了160.00%；Q的抑制作用不显著，且二者不存在显著的交互作用。以上说明，L可显著升高雄性繁殖器官指数，而对雌性繁殖器官的作用不显著，与之不同的是，Q对雌性的子宫指数和雄性的睾丸指数均具有显著的抑制作用。

表1 不育剂对布氏田鼠器官指数影响的双因素方差分析

2.4 不育剂对布氏田鼠激素水平的影响

不育剂对布氏田鼠的激素水平影响不同(表2)。不育剂对布氏田鼠血清中雌二醇、睾酮和皮质酮含量的影响不显著；L仅显著抑制布氏田鼠血清中促卵泡生成素的表达量，当Q不存在时，L的抑制作用为11.83%，Q存在时，L的抑制作用则达到55.38%。说明L对促卵泡生成素的抑制作用在Q的参与下得到了加强。

表2 不育剂对布氏田鼠激素水平影响的双因素方差分析

续表2 不育剂对布氏田鼠激素水平影响的双因素方差分析

3 结论与讨论

本研究发现，Q和L均显著抑制布氏田鼠的繁殖，前者的不育控制效果较好；Q可显著降低布氏田鼠的体质量，L则无此作用；Q显著抑制子宫指数(-64.20%～-30.56%)和睾丸指数(-43.16%～-3.22%)，L则削弱了Q对二者的抑制作用；L显著升高睾丸指数(-2.11%～66.67%)和附睾指数(18.18%～160.00%)，Q促进L对二者的升高作用；L显著抑制血清促卵泡生成素的表达量(-55.38% ～-11.83%)，Q提升L的抑制作用。总体上，Q对布氏田鼠的繁殖具有抑制作用，L的抑制作用较弱，二者混用可降低Q的有效抑制作用。

不育剂对田鼠体质量的抑制效果是剂量依赖的。李季萌等[31]发现，给布氏田鼠每周灌胃80、120、160 mg/kg的雷公藤，共持续4周，120 mg/kg的剂量在灌胃第2周可以显著降低田鼠的体质量，这和本研究结果一致。霍秀芳等[32]研究表明，以25、50、100、200 mg/kg的贝奥不育剂给布氏田鼠灌胃，200 mg/kg的剂量可以使田鼠的体质量从第1周到第4周持续降低，100 mg/kg的剂量在第2周降低最为显著，其他2个剂量几乎没有变化。不育控制的原理不是通过抑制个体发育达到控制个体繁殖的目的，而是通过不育个体参与繁殖竞争而产生的竞争性繁殖干扰效应达到不育控制的目的，所以应该避免对不育个体造成致命的伤害，剂量应尽可能不影响其生长发育[14]。本研究发现，以2 mg/kg的剂量给布氏田鼠灌胃，Q对体质量的抑制作用显著，其在灌胃结束后14 d达到最低，而L则促进体质量的上升，但作用不显著。

王涛涛等[30]研究表明，Q可以降低布氏田鼠雌性个体的繁殖率和平均窝仔数。本研究发现，L和Q均会抑制布氏田鼠的繁殖，但Q的繁殖抑制效果较好，与上述研究基本一致。由于仅有一组给药处理的个体繁殖，无法确定胎仔数和质量方面的差异性。

王大伟等[29]研究表明，以2 mg/kg的EP-1给雌性布氏田鼠灌胃，对子宫指数、卵巢指数均无显著的抑制作用。本研究则发现，Q可以显著降低子宫指数，当L不存在时，Q的降低作用为64.20%，当L存在时，Q的降低作用为30.56%，但L对子宫指数的抑制作用不显著。推测存在差异的原因可能为：EP-1是L和Q 2∶1的混合物，Q的份量较轻，减轻了效果；另外，对照组有一个子宫本体肥大，一个刚生育完，子宫肥厚还未恢复，还有一个刚妊娠，里面有胎仔，这些都增加了对照组子宫的总质量。L和Q对子宫外形的影响不显著，给药组子宫形态细长、壁薄，但这只是少数现象，并不呈现规律性。同时，L和Q对卵巢组织和卵巢指数都没有显著的影响。

Zhao等[11]用1 mg/kg的EP-1、0.34 mg/kg的Q以及0.66 mg/kg的L分别给布氏田鼠灌胃30 d、60 d和90 d后发现，Q可抑制雄性的繁殖，降低其睾丸和附睾质量，切片也显示，其曲细精管变得稀疏，精子数减少。本研究结果支持上述发现，Q显著抑制睾丸指数，当L不存在时，Q的抑制作用达到了43.16%，当L存在时，Q的抑制作用仅为3.22%，L的存在削弱了Q的抑制作用。切片也显示，Q使睾丸曲细精管的腔隙增大，各级精细胞减少。此外，还发现，L可显著升高睾丸指数(-2.11%～66.67%)和附睾指数(18.18%～160.00%)，Q的存在使得L的升高作用更明显，其作用机制还有待于进一步研究。

张锦伟等[14]研究表明，采用4～64 mg/kg的Q处理可使血清中促卵泡生成素表达量升高。本研究结果与其不一致，L显著抑制布氏田鼠血清中促卵泡生成素的表达量，Q的存在可以强化L的抑制作用，即当Q不存在时，L的抑制作用为11.83%，Q存在时，L的抑制作用则达到55.38%。促卵泡生成素含量降低，说明二者的协同作用引起体内下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈，这与以前的研究结果[33]类似。本研究还发现，L和Q对布氏田鼠血清中雌二醇、睾酮和皮质酮含量的影响不显著。雌二醇是由颗粒细胞分泌，协助促卵泡生成素以促进排卵，其含量变化不大，说明这2种药物并未对雌二醇的分泌造成影响，可能是由于该激素不是造成排卵的主要激素，也可能是生殖系统激素紊乱，这与张锦伟等[14]得到的结果类似。睾酮由睾丸间质细胞分泌，其作用是促进生殖器官的发育成熟及精子的成熟，睾酮变化不大，可能与采血的时机有关，本研究采血是在灌胃结束后的30 d，推测此时不育剂造成的血清睾酮含量降低的情况得到了恢复。皮质酮是一种应激反应的激素，灌胃和给药均会引起动物的应激反应，然而本研究中给药并未引起皮质酮的变化，可能也与所测时间有关，30 d后可能动物的应激反应已恢复正常，这与体质量也恢复正常保持一致。

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