健康烟田与易感黑胫病烟田烟株不同生长时期根际土壤微生物区系变化规律

张笑宇，段宏群，芦阿虔，李红丽，王 岩*

(1.郑州大学 化工与能源学院，河南 郑州 450001； 2.河南省洛阳市烟草公司，河南 洛阳 471000)

烟草黑胫病(病原为Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是一种重要的真菌型土传病害，严重影响烟叶产量和品质，甚至导致绝收。对烟草黑胫病的防治通常采用选育抗病品种、化学防治、生物防治和加强栽培管理等措施，由于化学农药的滥用和烟草抗病品种种植年限的增加，造成黑胫病病原菌产生抗药性和品种抗病性逐渐丧失等后果，势必影响烟草的安全生产，同时也对周边环境造成污染，严重制约烟草行业的可持续发展[1]，而生物防治是利用自然界存在的拮抗微生物抑制植物病原菌的繁殖，具有安全、无污染、无公害的特点，符合烟草有害生物综合治理的发展方向[2-3]。

土壤生物学性状能够反映土壤质量和肥力特征，是评价土壤健康的重要生物学指标[4]，土壤微生物对土传病害的抑制能力是土壤生态系统平衡、健康和稳定的另一个重要指标[2,5]。本研究对河南省汝阳县柏树乡水磨村多年公认的健康和易感黑胫病烟田进行了调查取样，通过高通量宏基因组测序技术对烟株生长过程中根际土壤微生物区系进行测定，旨在明确烟田根际土壤微生物的变化规律，为通过采取生物技术措施确保烟田土壤健康提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验田概况与材料

河南省汝阳县柏树乡植烟历史悠久且管理精细，烟叶品质优良。2016年通过实地调查，确定以柏树乡水磨村为试验点。在柏树乡水磨村选择连续植烟多年而发病率较低的健康烟田(T1)和发病率较高的易感病烟田(T2)，烟田种植情况和土壤基本性状如表1和表2所示。分别于移栽前、旺长期和成熟期采集土样，按S形进行多点取样，将烟株0～20 cm耕层根系区土样挖出，抖掉根系外围大块土，取贴根表的土壤作为根际土壤并进行编号[6]。将编号的土样带回实验室处理和测定：部分风干过筛，用于土壤理化性状测定；部分置于4 ℃冰箱保存，用于检测可培养微生物数量；部分装离心管-20 ℃冷冻保存，用于土壤微生物高通量宏基因组测定。

表1 试验田概况

表2 试验田土壤理化性质

1.2 试验方法

1.2.1 可培养微生物数量的测定 土壤中可培养微生物数量测定采用稀释平板法[7]。细菌用牛肉膏蛋白胨培养基；真菌用孟加拉红培养基；放线菌用高氏1号培养基。

1.2.2 微生物高通量宏基因组测序分析 将土壤样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行微生物高通量宏基因组测序分析，过程和方法如下。烟田根际土壤经过预处理后，利用OMEGA试剂盒提取土壤DNA。对提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，检查基因组DNA的完整度，并利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量。以全部基因组DNA为模板进行PCR扩增，细菌16S rDNA扩增引物分别为341F：5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode)CCTACGGGN-

GGCWGCAG-3′，805R：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATC-

C-3′；真菌18S rDNA扩增引物分别为NS1：5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，Fung：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGT-

TG-3′。PCR扩增体系:2×TaqMaster Mix 15 μL，基因组 DNA 20 ng，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物 (10 μmol/L) 1 μL，加H2O至30 μL。反应条件: 第1轮扩增首先94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，25个循环，最后72 ℃延伸5 min；第2轮扩增在相同条件下进行5个循环。PCR扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用生工生物工程公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒对DNA进行回收，然后进行测序分析。

OTU为将所有样本按照序列间的距离进行聚类，然后将相似度高于97%的序列定义为一个操作分类单元，故OTU数可表示烟田根际土壤中物种数量的多少，序列比对、聚类分析采用的软件为Usearch。用香浓指数衡量群落之间差异性，以Chao1指数的大小估计土壤微生物物种总数[8]，采用Mothur软件分别按照公式(1)和公式(2)计算这2项指标。

Hshannon=-∑Sobsi=1niNlnniN

(1)

式(1)中，Hshannon表示香浓指数，Sobs为实际检测到的OTU数，ni为含有i条序列的OTU数，N为序列总数。

Schao1=Sobs+n1(n1-1)2(n2+1)

(2)

式(2)中，Schao1即Chao1指数为估计OTU数，Sobs为实际检测到的OTU数，n1为只含有1条序列的OTU数，n2为只含有2条序列的OTU数。

群落结构分布图首先是采用RDP classifier软件，将OTU在属水平上所对应的物种信息按照分类学进行分类，然后采用R语言进行作图。聚类树状图首先采用R语言中Vegan软件包根据各个样本物种丰度计算beta多样性(样本间物种多样性)，依据距离矩阵进行层次聚类分析，然后再使用非加权组平均法(UPGMA)构建树状结构，用于可视化分析。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2013、SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 健康与易感病烟田根际土壤中可培养微生物数量的变化规律

如表3所示，烟株生长过程中根际土壤微生物数量变化较大，烟田根际土壤中可培养细菌、放线菌和真菌数量移栽前均较少，旺长期则明显增多，且细菌和放线菌的增长幅度远大于真菌，成熟期微生物数量又表现出一定程度的下降趋势，造成这一趋势的原因可能是旺长期的温度适宜微生物的生长和繁殖，且此时烟株根系生长旺盛，根系分泌物增多以及酶活性提高，从而导致微生物数量显著增长[9]，成熟期烟株根系活力下降，根系分泌物减少甚至分泌一些有毒物质[10-11]，进而使得微生物数量有所降低。同时还发现，健康烟田根际土壤中可培养细菌、放线菌和真菌数量在移栽前与易感病烟田差异不显著，而在旺长期和成熟期健康烟田中可培养细菌和放线菌的数量显著大于易感病烟田。细菌是土壤中的主要微生物，在土壤微生态环境的物质和能量转化中起着重要作用，放线菌能够改善土壤团粒结构，代谢产物中含有刺激植物生长的有效物质，且放线菌产生的抗生素能调节土壤微生物区系，抑制病原菌，控制病虫害发生[10,12]，因此健康烟田中细菌和放线菌数量增加，对于抑制病害发生具有重要作用。真菌则与细菌和放线菌相反，在旺长期和成熟期健康烟田中可培养真菌数量小于易感病烟田，并在成熟期达到显著性差异水平，造成这种变化的原因可能是由于烟株生长后期病原菌数量急剧增加，对可培养真菌数量有一定程度的影响[13]，这与李佳等[9]研究得出的易感病烟田中土壤微生物数量的变化规律一致。

表3 健康与易感病烟田中可培养微生物数量 ×104 cfu/g

注：不同的小写字母表示不同处理间同一微生物类别差异显著(P<0.05)。

2.2 健康与易感病烟田根际土壤微生物Alpha多样性分析

Alpha多样性也被称为生境内物种多样性，主要关注均匀生境下的物种数目[14]，利用Alpha多样性分析中的OTU数、香浓指数和Chao1指数对烟田根际土壤中微生物多样性进行判断。健康与易感病烟田根际土壤微生物Alpha多样性测定结果如表4所示。

表4 健康与易感病烟田微生物Alpha多样性分析

由表4可知，随着烟株的生长，烟田根际土壤细菌群落的OTU数、香浓指数和Chao1指数基本呈逐渐下降趋势，表明烟株生长过程中根际土壤细菌多样性逐渐降低；除旺长期健康烟田根际土壤细菌群落Chao1指数略低于易感病烟田外，移栽前、旺长期和成熟期健康烟田细菌群落的OTU数、香浓指数和Chao1指数均高于易感病烟田。而烟田土壤真菌群落变化相对复杂一些，在烟株生长过程中烟田根际土壤真菌群落OTU数逐渐降低，香浓指数先升高后降低，健康烟田根际土壤真菌群落Chao1指数逐渐降低，易感病烟田根际土壤真菌群落Chao1指数先降低后升高；除旺长期健康烟田真菌群落香浓指数略低于易感病烟田之外，移栽前和旺长期真菌群落多样性均高于易感病烟田，成熟期则相反，易感病烟田中真菌群落OTU数和Chao1指数均高于健康烟田，充分说明成熟期易感病烟田真菌物种多样性提高，可能是由于成熟期病原菌的大量生长所致。

2.3 健康与易感病烟田根际土壤微生物群落结构相似性分析

聚类树状图是通过树状结构反映多个样本间的相似度和差异性，健康与易感病烟田根际土壤微生物在属水平上的群落聚类树状图如图1所示。

a:细菌；b:真菌图1 属水平健康与易感病烟田根际土壤微生物群落聚类分析

从图1可以看出，健康烟田和易感病烟田微生物群落结构在移栽前和旺长期相似度均较大，但是随着烟株的生长，到成熟期时健康烟田和易感病烟田根际土壤微生物群落结构表现出较大的差异性，说明土壤微生物多样性发生了较大的改变，这种变化可能是由于病原菌在侵入寄主过程中或侵入后，在一定程度上干扰植物的正常代谢，引起根系分泌物的改变造成的[15]，由此推测发病烟株中黑胫病病原菌可能诱导了根际环境发生相应变化，从而导致烟田微生物结构的改变。

2.4 健康与易感病烟田根际土壤中微生物群落分布规律

根据微生物高通量宏基因组测序结果可知，移栽前健康烟田和易感病烟田根际土壤微生物在属水平上分别检测出细菌458类和503类，旺长期分别检测出358类和377类，成熟期分别为384类和383类。

由图2可知，在移栽前、旺长期和成熟期，Gp6、Gemmatimonas(芽单胞菌属)、Sphingomonas(鞘脂单胞菌属)、Gp4和Pseudomonas(假单胞菌属)这5类细菌为优势菌属，健康烟田与易感病烟田根际土壤中上述5种优势细菌移栽前相对丰度分别为29.19%和24.50%，旺长期分别为32.68%和36.11%，成熟期分别为35.39%和30.37%，可知烟株不同生长时期优势细菌属的种类和丰度差异不大。从图2还可以看出，Pseudomonas的相对丰度在烟株生长过程中呈现先增加后降低的趋势，旺长期达最大值，成熟期健康烟田根际土壤中Pseudomonas的相对丰度为5.16%，高于易感病烟田(3.77%)。有文献表明，Pseudomonas是环境微生物中代谢烟碱的优势种群，可以通过固氮作用产生多种植物激素以促进烟株对水分和矿质元素的吸收[8,16]，因此，Pseudomonas数量增加，有利于烟株生长。随着烟株生长，Sphingomonas的相对丰度在健康烟田根际土壤中逐渐增加，在易感病烟田根际土壤中则是先降低后增加，旺长期健康烟田中Sphingomonas的相对丰度(7.02%)高于易感病烟田(6.75%)。有文献表明，Sphingomonas是降解土壤有毒物质最有效的微生物菌属之一，且可以促进烟株根际营养吸收、抵抗多种病原菌，该属中某些菌株具有固氮和脱氢特性，在维持植烟土壤氮平衡方面起着重要作用[8]，旺长期烟株以营养生长为主，这一时期健康烟田Sphingomonas数量的增加，能够促进根系营养吸收，抑制病害发生。

图2 属水平健康与易感病烟田根际土壤细菌群落结构分布

根据微生物高通量宏基因组测序结果可知，移栽前健康和易感病烟田根际土壤微生物在属水平上分别检测出真菌223类和211类，旺长期分别为200类和221类，成熟期分别为159类和148类。

由图3可知，移栽前健康烟田和易感病烟田根际土壤真菌中Gibberella(赤霉属)、Penidiella、Setomelanomma为优势菌属，相对丰度分别为51.85%和51.58%；旺长期健康烟田根际土壤真菌中Penidiella、Thielavia(梭孢壳属)、Spizellomyces为优势菌属，占29.13%，易感病烟田中Spizellomyces、Thielavia、Setomelanomma为优势菌属，占35.10%；成熟期健康烟田中Conocybe(锥盖伞属)为优势菌属，占56.90%，易感病烟田中Phytophthora(疫霉属)为优势菌属，占60.43%。可知烟株不同生长时期优势真菌属的种类和丰度差异较大。其中Phytophthora是烟草黑胫病病原菌所在属[17]，在烟株生长过程中其相对丰度不断升高，成熟期达到最大值，且成熟期易感病烟田中Phytophthora的相对丰度(60.43%)明显高于健康烟田(0.32%)。有研究表明，发病率或发病指数与土壤中病原微生物的数量成正比[18]，因此，黑胫病病原菌数量的增加，提高了易感病烟田中黑胫病的发病概率。成熟期健康烟田根际土壤中Conocybe的相对丰度远高于易感病烟田，文献表明，Conocybe中某些真菌会分泌邻苯二甲酸二异丁酯[19]，而邻苯二甲酸二异丁酯能显著抑制茄子黄萎病菌菌丝生长[20]，因此推测烟田中Conocybe的分泌物邻苯二甲酸二异丁酯可能对黑胫病病原菌生长也具有一定的抑制作用。

图3 属水平健康与易感病烟田根际土壤真菌群落结构分布

3 结论与讨论

微生物是土壤中物质转化的重要参与者，在有机质的矿化、腐殖质的形成和分解、植物营养的转化、土壤污染修复、抑制病原菌活性等过程中起着不可替代的作用[21]。传统的纯培养技术仅能分离出1%～10%的土壤微生物，而分子生物学技术为不可培养微生物的分析提供了有利的手段，具有检测极限低、灵敏度高等优势，已经广泛应用于环境微生物研究中[22]。本研究测定分析了健康和易感病烟田在烟株生长期根际土壤微生物数量及其多样性的变化特征，结果表明，在烟株生长过程中可培养细菌、放线菌和真菌数量呈先增加后减少的趋势，旺长期达到最大值，旺长期和成熟期健康烟田根际土壤中可培养细菌和放线菌数量远远大于易感病烟田，使得健康烟田土壤抑病活性增加，发病率降低，而旺长期和成熟期易感病烟田可培养真菌数量大于健康烟田。利用分子生物学方法测定烟株不同生长时期健康与易感病烟田根际土壤微生物群落结构，结果表明，随着烟株生长，烟田根际土壤微生物群落多样性总体上逐渐降低，土壤微生物趋向单一化，土壤病原微生物得到富集，不仅不利于土壤中微生物种群的平衡，而且易导致植物根部病害的发生[4,23]，健康烟田微生物群落多样性基本大于易感病烟田，同时成熟期健康与易感病烟田微生物群落结构差异性较大。通过进一步对微生物群落结构分布分析发现，旺长期健康烟田根际土壤中Sphingomonas的相对丰度高于易感病烟田，成熟期健康烟田根际土壤中Pseudomonas、Conocybe的相对丰度高于易感病烟田，同时易感病烟田中病原菌Phytophthora的相对丰度在成熟期显著增加，远远高于健康烟田。

本研究只关注了不同生长时期烟株根际土壤微生物的变化情况以及健康烟田与易感病烟田微生物数量及区系的不同表现，为利用土壤微生物抑制烟株生长过程中病害的发生提供了理论依据和指导，但未考虑烟株地上部分的生长情况及烟株病害发生的其他影响。

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