基于低场核磁共振优化的罗非鱼片无磷保水剂及其配方研究

关志强， 马超锋， 李 敏， 任婷婷

(广东海洋大学机械与动力工程学院，广东 湛江 524088)

罗非鱼是中国南方养殖规模较大的品种之一。据不完全统计，2016年总产量达到17万t，其产品常采用冷冻的方式销往国外。冷冻产品在运输、销售过程中常因蛋白质冷冻变性和“脱水现象”引起持水力下降，从而降低感官品质，给冷冻罗非鱼进一步深加工带来了极大的挑战[1]。磷酸盐作为优良的保水剂，不仅可以减少冷冻产品加工过程中的汁液流失，还可以改善肌肉嫩度，提高出品率，在水产品冻藏保鲜方面应用较多[2-3]。研究表明，多聚磷酸盐完全水解会降低蛋白质水合能力[4]；同时，磷酸盐添加量不能超过0.5%，否则会使肉制品产生难闻的金属涩味和肥皂味[5]。贮藏过程中，其沉淀作用也会导致水产品表面出现“雪花”和“结晶”现象[6]，食用后会诱发心脑血管疾病[7]。因此，开发无磷保水剂，解决磷酸盐超标引起的安全问题具有一定的现实意义。研究发现，柠檬酸钠、木糖和壳聚糖对水产品都有一定的保水性能[8-10]。由于无磷保水剂价格较高，在一定程度上制约了其大范围的推广应用。

低场核磁共振(LF-NMR)通过检测质子在磁场中的弛豫性来获取食品中水分迁移和肌肉微观结构变化的信息。由于其在检测前无需对样品进行预处理，灵敏度高，对样品损伤小等特点，已被广泛用于鱼糜制品水分状态的检测中[11- 12]，但利用LF-NMR研究罗非鱼片保水性的报道较少。本研究结合LF-NMR的检测技术，分别以柠檬酸钠、木糖和壳聚糖对冻藏罗非鱼片的持水性进行研究，再通过正交复配试验，旨在寻找一种可以替代磷酸盐的复合无磷保水剂配方。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼购于湛江市工农市场；尼龙真空蒸煮袋购于上海易诺包装材料有限公司；柠檬酸钠(A)、木糖(B)、水溶性壳聚糖(C)(脱乙酰度为96.1%)、复合磷酸盐(0.2%焦磷酸钠，0.2%三聚磷酸钠，0.1%六偏磷酸钠) 均为食品级，购于河南千志商贸有限公司。试验设备包括HHS型恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)、AUY220型分析天平(日本岛津仪器有限公司)、MicroMR核磁共振交联密度仪(上海纽迈电子科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

选用鲜活罗非鱼，条重1 kg左右，去内脏、去皮、去骨，切割成6 cm×5 cm×1 cm(厚)大小的片状，称重；在4 ℃溶液(表1)中浸泡1 h，应确保鱼片全部浸入浸泡液，每隔15 min搅拌一次，沥干，称重，然后进行真空包装，并于-20 ℃条件下冻藏15 d。以复合磷酸盐溶液浸渍作为对照组，蒸馏水浸渍作为空白组。

表1 保水剂种类及质量浓度

1.2.2 单因素实验设计

保水剂种类及质量浓度见表1。以浸泡增重率、解冻损失率、蒸煮损失率、弛豫时间T2为检测指标，最终确定单个保水剂的最佳使用质量浓度。

1.2.3 正交实验设计

根据单因素实验结果，以浸泡增重率、解冻损失率、蒸煮损失率为指标，进行L9(34)正交实验，其因素水平见表2。

表2 正交实验因素水平表

1.2.4 浸泡增重率测定

取出浸泡好的鱼片，沥干至无液滴滴下，用滤纸吸去表面水分并称重，每个样品3个平行处理，取平均值。

(1)

式中：W1—浸泡增重率，%；m1—浸泡后鱼片质量，g；m2—浸泡前鱼片质量，g。

1.2.5 解冻损失率测定

将冻藏15 d后的冻罗非鱼片流水解冻，沥干，然后用滤纸擦去表面水分，称重并记录，每个样品3个平行处理，取平均值。

(2)

式中：W2—解冻损失率，%；m3—鲜鱼片质量，g；m4—解冻后鱼片质量，g。

1.2.6 蒸煮损失率测定

将解冻后的鱼片装入铝箔蒸煮袋中，用真空包装机密封，然后放入65 ℃水浴锅中蒸煮15 min[13]，取出冷却至室温，用滤纸吸干样品表面水分并称重，每个样品3个平行处理，取平均值。

(3)

式中：W3—蒸煮损失率，%；m5—蒸煮前鱼片质量，g；m6—蒸煮后鱼片质量，g。

1.2.7 弛豫时间T2测定

应用纽迈台式脉冲NMR分析仪进行NMR自旋，并测量自旋弛豫时间(T2)。取规格为1 cm×1 cm×1 cm、质量约为2 g的罗非鱼肉放入直径17 mm的核磁管中。测试参数：分析磁体线圈10 mm，测量温度32 ℃，起始脉冲宽度5.0 μs，结束脉冲宽度35.0 μs，累加步长1.0 μs，射频信号频率主值SF1=22 MHz，射频信号频率偏移量O1=840 152.79 Hz，重复采样间隔时间TR=1 000 ms，90°脉宽P1=13 μs，180°脉宽P2=26 μs，采样点数TD=1 024，采样频率SW=200 kHz，回波时间TE=300 μs，回波个数NECH=5 000，重复采样次数NS=4，采样起始点控制参数D3=80 μs，迭代次数RT=100 000。每个样品做3个平行。

1.2.8 质构测定

采用二次挤压质构分析法(TPA)测定罗非鱼片的质构。测定参数：力量感应元大小为1 000 N，探头升高到距样品表面12 mm，形变量50%，检测速度60 mm/min，起始力0.5 N。每个处理做3个平行，重复测量3次。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同保水剂对罗非鱼片浸泡增重率的影响

由图1可知，经不同保水剂合适质量浓度处理的罗非鱼片浸泡增重率均有所提高。木糖处理的浸泡增重率最高为4.99%，高于对照组的2.38%，可能是因为木糖是多羟基醛糖，通过毛细血管力等作用渗透到肌肉中，与蛋白质发生作用，扩大了肌原纤维的结构空间，从而使更多的水分渗入鱼肉肌纤维间隙中[14]。柠檬酸钠和壳聚糖浸泡增重效果显著，一定浓度范围内浸泡增重率高于对照组。柠檬酸钠在质量浓度2.0%时，浸泡后质量明显增加，浸泡增重率高达7.54%。张雪莹等[10]研究发现，柠檬酸钠质量浓度0.2%时，浸泡增重率可达4.76%。浸泡增重率是反映鱼肉保水性的重要指标之一。柠檬酸钠保水作用机理主要表现在两个方面：一是借助二价金属离子与鱼肉中金属离子螯合后释放的羧基间的排斥作用，引起蛋白质结构松散，从而提高其保水性；二是柠檬酸钠显碱性，可提高鱼肉体系的pH，也可使体系离子强度增大，易导致肌球蛋白溶胶状态的形成，最终提高鱼肉保水性[15]。壳聚糖在质量浓度2.0%时，浸泡增重率最高，为5.33%，可能是壳聚糖与蛋白质间的交联作用优化了蛋白质分子结构，使形成的凝胶空间结构更加紧密，有助于吸附更多的水分，并引起罗非鱼片质量增加[16]。这与白青云等[17]的报道一致，适量的壳聚糖有助于提高肌肉的保水性。

图1 不同质量浓度不同保水剂对罗非鱼片浸泡增重率的影响

2.1.2 不同保水剂对罗非鱼片蒸煮损失率的影响

鱼肉肌肉组织常因冷冻过程中形成的不规则冰晶的挤压而变形收缩，从而导致截留水分的能力降低。解冻时肌肉蛋白也会因汁液流失而变性，高温蒸煮过程中变性蛋白质更易发生聚集和热变性，进一步降低持水力，并最终加剧质量损失[18- 19]。由图2可知，不同质量浓度不同保水剂处理的罗非鱼片蒸煮后质量都有所损失，但都低于对照组(损失率最高为16.65%)。柠檬酸钠和壳聚糖对罗非鱼片蒸煮损失率的影响基本一致，都呈先降低后升高的趋势。柠檬酸钠在质量浓度2.0%时达到“谷值”，为3.84%，可能是该质量浓度条件有助于鱼肉中肌原纤维蛋白数目的增加，高温作用下蛋白质发生变性，致使一部分水和脂质被滞留在鱼肉中，从而有效阻止了肌肉中水分的流失[20]。3.0%壳聚糖浸泡过的罗非鱼片蒸煮损失率为14.27%，是壳聚糖浸泡组中汁液流失最少的组。罗赞艳等[21]研究发现，经0.1%壳聚糖溶液浸渍或喷涂处理的冷鲜牛肉蒸煮损失率显著低于对照组(P<0.05)，说明壳聚糖对降低罗非鱼片蒸煮损失率有一定的效果。木糖处理过的罗非鱼片蒸煮损失率变化基本呈上升趋势，当木糖质量浓度为0.1%时，蒸煮损失率为本组最低，蒸煮损失率达到10.96%，可能是因为木糖中的-OH与水分子中的-H结合比较紧密，从而降低蒸煮过程中水分的损失。

图2 不同质量浓度不同保水剂对罗非鱼片蒸煮损失率的影响

图3 不同质量浓度不同保水剂对罗非鱼片解冻损失率的影响

2.1.3 不同保水剂对罗非鱼片解冻损失率的影响

解冻损失率是衡量罗非鱼肌肉保水性的重要指标之一[22]。由图3可知，对照组罗非鱼片解冻损失率为8.14%。当柠檬酸钠质量浓度为1.0%时，罗非鱼片解冻损失率低至2.96%。李莎莎等[23]研究发现，添加0.4%柠檬酸钠的冷冻鱼糜解冻损失率最小，保水效果显著(P<0.05)；张崟等[24]也有相似的结论。这可能是因为柠檬酸钠螯合了Ca2+、Mg2+等离子，形成的肌纤维空间结构更紧密，有效阻止了解冻过程带来的水分流失。木糖质量浓度为0.1%时，木糖组解冻损失率最低，为4.49%，与浸泡增重率、蒸煮损失率的结果一致。可能是木糖降低了罗非鱼片的解冻速率，使细胞间隙的冰晶在缓慢融化过程中可充分地被重新吸附到细胞中去，从而有效缓解了解冻时因细胞膜破裂造成的水分流失现象[25]。壳聚糖质量浓度为4.0%时，解冻损失率降至4.98%。解冻后罗非鱼片质量减轻不仅与解冻时的汁液流失有关，还与冻藏过程中的干耗相关，“干耗”现象主要由冰晶升华或水分的蒸发引起[26]。王玲等[27]研究发现，壳聚糖冰衣可有效降低虾肉冻藏过程中的干耗和解冻时的汁液流失，本研究结果与其一致。

2.1.4 不同保水剂对罗非鱼片中不同状态水分子含量的影响

经不同保水剂处理的罗非鱼片横向弛豫时间T2图谱如图4～图6所示。

图4 添加柠檬酸钠的罗非鱼片弛豫时间T2曲线谱图

图5 添加壳聚糖的罗非鱼片弛豫时间T2曲线谱图

图6 添加木糖的罗非鱼片弛豫时间T2曲线谱图

添加保水剂的罗非鱼片肌肉中含有3种不同状态的水分子：结合水T20(0～1 ms)，可移动水T2a(400～1 500 ms)，游离水T2b(40～60 ms)。其中，T2a存在于蛋白质高级结构中，含量最高，占90%左右。它反映了鱼肉网状结构对水分的滞留能力，T2a越短，说明水分受到的束缚力越强，流动性就越低，峰的位置越靠左，从而提高了肌肉的保水性[28]。T20、T2a、T2b各峰与横坐标围成的积分面积所占的百分比为各状态水分的含量，分别记为A20、A2a、A2b。由表3可知，对照组A2a为96.63%，可能是冻藏过程中鱼肉组织机构部分遭到破坏，束缚力降低。添加保水剂后，罗非鱼片A2a都有所升高。其中，1.0%柠檬酸钠处理组上升显著，高达97.47%(P<0.01)。杨文鸽等[29]研究发现，经0.5%柠檬酸钠漂洗的带鱼鱼糜凝胶可移动水含量显著高于空白组和单一NaCl、CaCl2组以及复合漂洗组(P<0.05)。这可能是因为柠檬酸钠溶液促进了由肌原纤维结构松弛引起的亲水基团“裸露”进程，从而使水分在亲水基团作用下滞留在凝胶立体结构中。木糖浸渍处理的罗非鱼片A2a基本呈下降趋势，当质量浓度0.1%时达到峰值97.33%。壳聚糖处理组样品A2a均高于对照组，当质量浓度4.0%时，A2a可升至97.08%。周然等[30]研究证明，微酸性电解水和羧甲基壳聚糖联用，可减弱水蜜桃果肉呼吸强度和自由水的散失，贮藏44 d后依旧可以看到清晰的果皮组织。研究表明，肌肉的组织结构对其持水性和水分子状态都有一定的影响[31]。肌肉的持水性主要依靠肌浆蛋白分子、水分子极化基团间引力作用截留水分，其中，大部分水分被吸附在细胞膜内的肌浆中，少部分通过毛细管力被滞留在肌纤维细胞膜外，又被肌束膜紧紧包围，流动性降低[32]；也有研究认为，由肌原纤维膨胀引起的肌丝空间扩大，同样可以提高持水力[33]。

表3 不同保水剂预处理对冻藏罗非鱼片水分分布的影响

注：同一列小写字母表示不同处理组间的显著性差异(P<0.01),下同

2.2 正交实验结果

根据表2单因素实验结果，设计正交实验并进行优化(表4)。由表4可知，极差R越大，表明对应因素对结果影响越大。3种无磷保水剂对指标的影响主次顺序均为C>B>A，即壳聚糖>木糖>柠檬酸钠。浸泡增重率越大，鱼肉持水性越强，而解冻损失率、蒸煮损失率越高，鱼肉持水性越差，从而降低食用品质。因此，罗非鱼片最佳的复合无磷保水剂配方如果以浸泡增重率为指标就是A1B2C1，若以解冻损失率为指标就是A1B2C2，若以蒸煮损失率为指标便是A2B2C3。鱼肉受热过程中最明显的变化就是质量减轻，引起这种变化的主要原因是肌肉受热收缩挤出水分而造成严重的水分流失，即脱水现象，同时也伴随少量的脂肪分解产物、小分子含氮化合物的溶出。在生产过程中，蒸煮损失率是着重考察的指标，它与产品出品率密切相关。而A1B2C2蒸煮损失率远高于A2B2C3，首先排除前者的保水剂配方组合。另外，A1对浸泡增重率和解冻损失率较优，应优先选择。因素C对浸泡增重率、解冻损失率、蒸煮损失率的影响都是最大的，结合弛豫曲线选择C3，因素B对三者影响最优水平均为B2。因此，罗非鱼片复合无磷保水剂配方为A1B2C3，即0.5%柠檬酸钠、0.2%木糖、3.0%壳聚糖。该组合不在9组试验之列，需进行验证试验。

2.3 验证试验

验证结果见表5。

表4 正交实验直观分析

表5 验证试验

罗非鱼片经0.5%柠檬酸钠、0.2%木糖、3.0%壳聚糖组成的复合无磷保水剂处理后，浸泡增重率、解冻损失率、蒸煮损失率整体优于正交实验组，与蒸馏水处理差异显著(P<0.01)。经复合无磷保水处理的样品，其解冻损失率、硬度分别为2.17%、2.5 N，均优于传统复合磷酸盐处理组与蒸馏水处理的样品。与后者相比，浸泡培重率提高53.14%，解冻损失率降低52.1%，其蒸煮损失率降低44.55%，硬度提高31.6%。与复合磷酸盐处理组相比，各指标提升幅度范围在13.56%～44.09%，可以较好的取代复合磷酸盐保水剂，并具有较好的保水性能。

3 结论

(1)从单因素出发研究了柠檬酸钠、木糖、壳聚糖三种保水剂对冻藏罗非鱼片保水性能的影响，结果表明，经三种保水剂浸渍处理后，冻藏罗非鱼片的保水性能有较大程度的改善，且随着保水剂浓度不同，其保水效果有差异。三种保水剂对罗非鱼片都有良好的保水效果，一定浓度范围内优于未处理组。

(2)LF-NMR结果显示了经单一无磷保水剂处理的罗非鱼片肌肉组织内部三种状态水分子含量变化，其中，1.0%柠檬酸钠、0.1%木糖、4.0%壳聚糖处理的罗非鱼片A2a峰值分别为97.47%、97.33%、97.08%，进一步从微观结构上说明适量无磷保水剂可提高罗非鱼片的持水性。

(3)通过正交优化实验，获得无磷保水剂的复配方案为0.5%柠檬酸钠、0.2%木糖、3.0%壳聚糖。在优化复配方案下使用时，冻藏罗非鱼片浸泡增重率、蒸煮损失率、质构特性均优于复合磷酸盐和蒸馏水处理组。因此，该复合无磷保水剂的使用可弥补由复合磷酸盐不良反应引起的食品安全问题，对未来替代复合磷酸盐具有一定的优势。

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